光皮樺blknox家族基因表達(dá)及互作機(jī)制分析

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1、光皮樺BlKNOX家族基因表達(dá)及互作機(jī)制分析第一章文獻(xiàn)綜述1.1酵母雙雜交系統(tǒng)的研究進(jìn)展隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究重點(diǎn)從結(jié)構(gòu)基因過(guò)渡到基因所編碼的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是生物體中生命活動(dòng)的主要體現(xiàn)者，生物體中的絕大多數(shù)生命活動(dòng)都是在各種蛋白質(zhì)的參與下完成的。蛋白復(fù)合體或蛋白質(zhì)間的相互作用在有機(jī)體細(xì)胞的生命活動(dòng)中如細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原識(shí)別、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、遺傳信息的表達(dá)和調(diào)控等方面起重要的作用。目前用于研究蛋白質(zhì)的方法主要有酵母雙雜交、GSTpull-doactivatingsequence,UAS)結(jié)合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bindingdomain,BD)；另一

2、個(gè)是位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,AD)組成。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的，單獨(dú)的BD雖然可以和UAS結(jié)合但并不引起轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的AD不能與UAS結(jié)合，只有當(dāng)BD與AD分別表達(dá)形成的融合蛋白發(fā)生相互作用，GAL4轉(zhuǎn)錄因子才具有轉(zhuǎn)錄活性啟動(dòng)子下游基因的轉(zhuǎn)錄[10-12]。在GAL4系統(tǒng)中，報(bào)告基因有ADE2、HIS3、LacZ和MEL1，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選以及藍(lán)白斑結(jié)果靈敏地來(lái)篩選或驗(yàn)證兩個(gè)蛋白之間是否存在相互作用[13]。.1.2KNOX相關(guān)基因的研究進(jìn)展在生物的發(fā)育過(guò)程中同源異型盒基因編碼的蛋

3、白作為轉(zhuǎn)錄因子起重要的調(diào)節(jié)作用。從酵母、真菌到動(dòng)植物，大量的同源異型盒基被分離出來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，同源異型盒蛋白在生物的形態(tài)建成中發(fā)揮著重要作用。KNOX家族屬于TALE(threeamino-acidloopextension)同源異型盒蛋白超家族，其編碼的蛋白質(zhì)是非典型的同源異型盒蛋白包括四個(gè)區(qū)域MEINOX域、GSE域、ELK域、HD域。其中MEINOX域包括KNOXA域和KNOXB域是位于KNOX蛋白的N端的約100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的保守區(qū)域，KNOXA域在KNOX基因異源表達(dá)產(chǎn)生表型變化的過(guò)程中起重要作用，同時(shí)可能對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄起抑制作用，KNOXB域?qū)τ?/p>

4、二聚體的形成和轉(zhuǎn)基因植株異常表型的產(chǎn)生有重要作用。GSE域位于MEINOX域和ELK域之間，較小且保守程度不高，參與調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性[19]。ELK域編碼核定位信號(hào)，參與蛋白質(zhì)之間的相互作用。HD域位于KNOX蛋白的C端是典型的同源異型盒區(qū)，參與DNA的結(jié)合和同源二聚體的形成，包括63個(gè)氨基酸，在第1個(gè)螺旋與第2個(gè)螺旋之間存在3個(gè)額外的氨基酸(P-Y-P)[20-21]。KNOX基因分布廣泛，幾乎存在于所有的單子葉和雙子葉植物中?；谛蛄械耐葱?，研究者將KNOX基因分為KNOXI和KNOXII兩類。其中KNOXI在分生組織中表達(dá)，是分生組織發(fā)生與維持所必需的

5、關(guān)鍵基因，通過(guò)調(diào)控與器官發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞分化，最終影響側(cè)生器官的形態(tài)建成；KNOXII的表達(dá)模式多樣化，幾乎在所有的組織中都有表達(dá)，研究表明KNOXII基因參與調(diào)控植物細(xì)胞壁的次生生長(zhǎng)、同時(shí)在根和莖、種皮、心材等的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[5-7,22-27]。.第二章光皮樺BlKNOX基因表達(dá)分析與誘餌載體構(gòu)建2.1材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)材料（1）光皮樺5個(gè)KNOXcDNA全長(zhǎng)由本實(shí)驗(yàn)室其他成員提供，測(cè)序結(jié)果正確。（2）Y2H、Y187菌株來(lái)自Clontech公司。（3）大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。（4）pGBKT7、pGBKT7-53、p

6、GADT7-T、pGBKT7-Lam、pGADT7-T購(gòu)自Clontech公司2.1.2試劑HiFiTaq酶，PCRbuffer，dNTPs，DNA限制性內(nèi)切酶，DNALigationKit，瓊脂粉，葡萄糖，胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，瓊脂糖，二甲亞砜（DMSO），二甲基甲酰胺（DMF），PEG3350，LiAc，核酸凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒DNA純化試劑盒，氨芐青霉素粉末，DNA純化試劑盒，卡納青霉素粉末，快速酶切酶等試劑均購(gòu)自TaKaRa。酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。In-FusionHDCloingKit，X-α-Gal，Aureob

7、asidinA（AbA），SDMinimalmedium，-LeuDOSupplment，-TrpDOSupplment，-Leu/-TrpDOSupplment，-Leu/-Trp/-His/-AdeDOSupplment等試劑購(gòu)自Clontech公司。.2.2結(jié)果與分析基于轉(zhuǎn)錄組序列，以cDNA為模板，克隆光皮樺KNOX基因，結(jié)果獲得5個(gè)不同序列，分別命名為BlKNOX1-BlKNOX5。采用EditSeq分析，結(jié)果顯示BlKNOX1-BlKNOX5這5個(gè)基因的ORF長(zhǎng)度分別為927bp，858bp，960bp，1131bp和1362bp。通過(guò)Blast對(duì)

8、分析光皮樺KNOX基因結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，