青蒿琥酯對膀胱癌t―24細(xì)胞生長的影響

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1、青蒿琥酯對膀胱癌T―24細(xì)胞生長的影響　　摘要：目的探討青蒿琥酯（artesunate，Art）對人膀胱癌T-24細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。方法用不同濃度的Art干預(yù)人膀胱癌T-24細(xì)胞，采用MTT法檢測用藥后細(xì)胞增殖的改變；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測魚藤素對細(xì)胞遷移能力的影響；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞周期的改變和凋亡率。結(jié)果與對照組比較，Art可顯著抑制人膀胱癌T-24細(xì)胞株增殖（P<0.01）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚藤素可降低T-24細(xì)胞的遷移能力；FCM結(jié)果顯示Art可使人膀胱癌T-24細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并

2、可誘導(dǎo)T-24細(xì)胞的凋亡（P<0.01）。結(jié)論Art可顯著抑制T-24細(xì)胞的增殖以及降低其遷移能力，其機(jī)制可能與Art使T-24細(xì)胞生長周期阻滯在G0/G1期并誘導(dǎo)其凋亡相關(guān)?！　￡P(guān)鍵詞：膀胱癌；T-24細(xì)胞；青蒿琥酯；凋亡；細(xì)胞周期　　膀胱癌是泌尿外科最常見的腫瘤，現(xiàn)仍以手術(shù)治療為主，輔以化療以及免疫治療等其他治療方法，其中化療在其中起著關(guān)鍵的作用，但療效不是很顯著，治療指數(shù)低，且副反應(yīng)較大[1]，因此尋找新的、療效顯著的藥物迫在眉睫。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我國傳統(tǒng)中藥自主知識產(chǎn)權(quán)藥品

3、，但近期研究發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物對多種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制效應(yīng)，顯示出非常好的療效[2-6]。但其對膀胱癌的抑制作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察Art對人膀胱癌T-24細(xì)胞的抑制作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制，為Art下一步臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的臨床理論依據(jù)?！　?資料與方法　　1.1一般資料人膀胱癌T-24細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院惠贈；DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；優(yōu)級胎牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品；MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品；Art注射液為桂林南藥股份有限公司（批號0

4、30801）產(chǎn)品；磷脂結(jié)合蛋白（AnnexinV，LBMs306BB）以及碘化丙啶（PI）為美國Caltag公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為美國Beckmancoulter公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌T-24細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素）中，于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)?！　?.2.2細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTT法）將人膀胱癌T-

5、24細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液200μL。分組為：對照組、藥物組（使Art終濃度為10、40、60μmol/L）；待細(xì)胞貼壁生長后，藥物組細(xì)胞分別加入相應(yīng)濃度的Art，對照組中加入等體積培養(yǎng)液，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于370C，5%CO2條件下培養(yǎng)箱中分別孵育24、48、72h后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μl，再次置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，充分振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定

6、各孔光密度值OD490，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=（對照組D490值-用藥組D490值）/對照組D490值×100%?！　?.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Art對T-24遷移能力的影響將T-24細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使細(xì)胞密度為2×105個(gè)細(xì)胞/孔，分組為：對照組、Art組（40、60μmol/L），將細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24h后，用10μL槍頭于細(xì)胞層中劃一直線，形成寬度均勻一致的細(xì)胞傷口模型，每孔劃3條傷痕，用PBS洗掉懸浮的細(xì)胞后，再加入相應(yīng)濃度藥物，而對照組中加入等體積培養(yǎng)液，分

7、別在培育0、24、48h時(shí)，于光學(xué)顯微鏡（×100）下觀察并測量劃痕的寬度，分別計(jì)算3條平行劃痕的平均距離（每條劃痕各取3個(gè)固定位置計(jì)算距離），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞遷移能力以遷移率表示：遷移率=（原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度）/原劃痕寬度?！　?.2.4流式細(xì)胞儀（FCM）測定Art對T-24細(xì)胞周期以及凋亡的影響取處于數(shù)生長期的人膀胱癌T-24細(xì)胞，消化傳代后，重新接種于培養(yǎng)瓶，使其密度為5×105/ml；分組為：對照組、藥物組（使Art終濃度為10、40、60μmol/L）；待細(xì)胞貼壁后，藥物組細(xì)胞分別加入相應(yīng)

8、濃度的Art，對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，用70%冷乙醇分散固定細(xì)胞，4℃過夜。取固定好的細(xì)胞加PBS洗滌一次，離心棄上清，然后加入50μg/ml的RNase1ml置于37℃水浴鍋中30min，離心去上清，加入60μg/ml的PI1ml，避光孵育30min，經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，上機(jī)進(jìn)行檢測，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期以及凋亡分析?！　?.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x