青蒿琥酯對(duì)肝癌hepg

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1、青蒿琥酯對(duì)肝癌HEPG：陳永順，李靜，楊斌，陳氏紅【摘要】目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響和機(jī)制。方法MTT法測(cè)定青蒿琥酯對(duì)HEPG-2細(xì)胞增殖的影響，ELISA方法研究Caspase-3的活性，DNA電泳觀察細(xì)胞DNA的變化，免疫組化研究凋亡相關(guān)蛋白p53,bcl-2,bax的表達(dá)。結(jié)果青蒿琥酯作用細(xì)胞48h后可明顯誘導(dǎo)HEPG-2細(xì)胞凋亡，并影響Caspase-3,p53,bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論青蒿琥酯可明顯抑制HEPG-2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)HEPG-2細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能是

2、通過(guò)激活Caspase-3的活性，以及調(diào)節(jié)p53，bcl-2蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。【關(guān)鍵詞】青蒿琥酯;Casepase-3;P53　青蒿琥酯(Art)作為一種含內(nèi)過(guò)氧化基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯化合物，主要用于瘧疾治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，其還具有抗腫瘤作用[1]。本實(shí)驗(yàn)以人肝癌HEPG-2細(xì)胞株為作用對(duì)象，研究青蒿琥酯對(duì)腫瘤細(xì)胞株相關(guān)基因和蛋白的影響?！　?儀器與材料　　1.1儀器全自動(dòng)CO2孵箱(美國(guó)ThermoFormo)，倒置顯微鏡(日產(chǎn))，雷勃MK3酶標(biāo)儀，貝克曼熒光顯微鏡，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，DMR+Q5

3、50病理圖象分析系統(tǒng)(萊卡公司)。　　1.2試劑四唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自Sigma公司,青蒿琥酯購(gòu)于桂林南藥股份公司(批號(hào)060109);紫杉醇，上海華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科(批號(hào)060202)，Caspase-3檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，Annvie-FITC試劑盒(晶美生物公司)，P53-抗，bcl-2-抗,bax-抗(北京中杉生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，細(xì)胞凋亡DNA提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，DNAladder(廣州東盛生物技術(shù)開發(fā)有限公司)?！　?

4、.3細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HEPG-2細(xì)胞株從廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心病理科細(xì)胞室引進(jìn)，培養(yǎng)在含10%小牛血清，含青、鏈霉素各100u/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代?！　?方法　　2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性采用MTT法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEPG-2細(xì)胞，按每孔細(xì)胞3×103～5×103個(gè)，190μl接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，12h貼壁后加入各組藥物，藥物終濃度梯度為200，100，50μg/ml，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24，48

5、，72h，OD值測(cè)量波長(zhǎng)為雙波長(zhǎng)570nm/630nm。以下列公式計(jì)算抑制率：抑制率=(1-加藥組OD/對(duì)照組OD)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。　　2.2Caspase-3活性的研究經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的細(xì)胞，每2×106個(gè)細(xì)胞的比例加100μl裂解液，冰浴15min，4℃,16000g，離心15min，收集上清，采用Caspase-3ELISA試劑盒，按說(shuō)明書操作。由PNA不同濃度對(duì)應(yīng)的OD值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品空中OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得相應(yīng)樣品空中Caspase-3活性濃度?！　?.3DNALADDER的觀察收集Art

6、處理48h后的細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書，提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照。　　2.4p53,bcl-2,bax等蛋白的研究免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)p53，bcl和bax的表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明依次操作，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照?！　?結(jié)果　　3.1IC50的測(cè)定每個(gè)濃度梯度的抑制率得出后，采用Bliss法求得Art作用HEPG-2細(xì)胞的24，48，72h的IC50分別為(103.1±8.6)，(75.3±4.1)，(65.7±6.0)μg/ml[2]。　　3.2caspase-3活性的改變測(cè)得

7、OD值后，根據(jù)OD值由擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得相應(yīng)樣品空中活性Caspase-3的濃度(48h)。與空白組比較，藥物作用后細(xì)胞中Caspase-3濃度高于對(duì)照組(P<0.01)?！　?.4免疫組化結(jié)果細(xì)胞染色評(píng)分參考薛宏偉等的方法[3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HEPG-2肝癌細(xì)胞株的凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物p53、bcl-2、bax蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用青蒿琥酯(100μg/ml)處理48h后的肝癌細(xì)胞，p53蛋白表達(dá)低于細(xì)胞對(duì)照組，bax表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2及表2?！　?討論　　細(xì)胞凋亡是由基因編碼調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)

8、自殺過(guò)程，腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因的研究是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑的過(guò)程中起著非常重要的作用，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡最為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，因此，研究Caspase-3的活性，具有重要的意義[4]。　　本實(shí)驗(yàn)中各濃度青蒿琥酯作用后腫瘤細(xì)胞中caspase-3活性明顯高于對(duì)照組(P<