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《(09綜合實(shí)驗(yàn))殼聚糖微球的制備》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、殼聚糖微球固定木瓜蛋白酶的研究1殼聚糖微球的制備殼聚糖屬多糖類物質(zhì)，是一種生物相容性好、無毒、廉價(jià)易得的天然高分子生物材料。殼聚糖易于進(jìn)行化學(xué)改性，引入新的功能團(tuán)，尤其是殼聚糖分子中含有游離的氨基，通過化學(xué)交聯(lián)劑(戊二醛)很容易與酶發(fā)生間接共價(jià)結(jié)合，使酶牢固地固定在殼聚糖分子上。因此，殼聚糖是一類性能優(yōu)良的酶固定化載體。殼聚糖在酸性條件下溶解、堿性條件下沉淀，在較低濃度的NaOH溶液中，殼聚糖微球在還未完全沉淀成球以前就己經(jīng)塌陷，殼聚糖分子堆砌在一起，導(dǎo)致所成微球形態(tài)不好、強(qiáng)度較差、表面厚度不均一、凸凹不平、不能形成
2、良好的結(jié)構(gòu)。隨著NaOH濃度的增加，殼聚糖微球迅速成形，容易形成厚度均一、形態(tài)較好、韌性好的微球，此時(shí)微球表面被撐起，呈現(xiàn)出殼聚糖自身的疏松多孔結(jié)構(gòu)。不過當(dāng)其濃度達(dá)到20%，又不能成球，因?yàn)闈舛忍邅聿患俺汕蚓图航?jīng)粘連在一起，形成一片絮狀物。所以適宜的NaOH濃度范圍為7.5-15%。在NaOH溶液中加入乙醇后形成的殼聚糖微球更加圓潤，而且隨著溶液中乙醇含量的增加，殼聚糖微球的機(jī)械強(qiáng)度得到了加強(qiáng)，韌性越來越好，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，球表面產(chǎn)生了很多氣泡，微球懸浮在溶液中，不利于操作。故選取2.0%殼聚糖滴入10%
3、NaOH:乙醇=4:1的溶液中為較好的成球條件。殼聚糖2.0g溶于100mL、1.0%乙酸溶液中((20℃條件下)充分溶解，將殼聚糖溶液逐滴滴入250mL混合液(10.0%NaOH與95%乙醇，體積比為4:1)，得粒度均勻、形狀規(guī)整的殼聚糖微球，過濾收集殼聚糖微球，再用蒸餾水洗滌至中性，濕態(tài)保存。2殼聚糖微球的交聯(lián)：將1.0g殼聚糖微球置于100mL蒸餾水中，加入一定體積（0.6、1.0、1.4mL）的25%戊二醛，30℃下恒溫振蕩2.0hr，用大量水反復(fù)洗滌，以去除殘留的戊二醛溶液，即得殼聚糖微球載體。3木瓜蛋白酶
4、的固定化稱取上述殼聚糖微球載體，加入10mL的0.lmol/L磷酸緩沖溶液(pH=6.0、7.0、8.0)和10mL木瓜蛋白酶溶液（濃度為：0.5、1.0、1.5mg.mL-1），30℃下恒溫振蕩一定時(shí)間（3.0、4.0、5.0hr）。棄去上層溶液，用大量水反復(fù)洗滌載體，即得固定化木瓜蛋白酶。4酶活力測(cè)定在試管中加入1mL的0.lmol/L磷酸緩沖溶液(pH=7.0，內(nèi)含5mmol/L半胱氨酸和lmmol/LEDTA),3mL2%酪蛋白溶液(pH=7.0)，37℃水浴中預(yù)5min，然后加入一定量的酶，于37℃反應(yīng)30
5、min后加入5mL10%三氯乙酸溶液，振蕩后于37℃放置1Omin，過濾，測(cè)濾液在275nm處的吸光度?？瞻坠軇t先加入TCA溶液，再加酪蛋白溶液，其余與樣品管相同。以上酶活力測(cè)定過程中都作三個(gè)平行樣。酶活力單位(U)規(guī)定為每lOmin內(nèi)增加0.1個(gè)吸收單位對(duì)應(yīng)的酶量。5戊二醛濃度對(duì)固定化酶活力的影響2當(dāng)戊二醛濃度增大時(shí)，殼聚糖微球表面上的氨基連接的戊二醛增多，相應(yīng)地與戊二醛交聯(lián)的酶分子增多，所以固定化酶的活力增加。但是戊二醛既是固定化反應(yīng)的交聯(lián)劑，又是酶的變性劑，會(huì)使交聯(lián)殼聚糖球上的懸掛醛基量提高，固定化過程反應(yīng)劇烈
6、，懸掛醛基與酶蛋白分子上的氨基發(fā)生多點(diǎn)結(jié)合，酶分子過多，造成過于擁擠，改變了原有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，影響酶的活性。而且過量的戊二醛能使殼聚糖分子內(nèi)的氨基交聯(lián)，使殼聚糖的孔隙減小，增大了固定化酶的空間位阻。所以導(dǎo)致固定化酶的活力隨著戊二醛濃度的增加反而逐漸降低了。6加酶量對(duì)固定化酶活力的影響交聯(lián)后的殼聚糖，其活性基團(tuán)是一定的，因而在其結(jié)合位點(diǎn)未飽和之前，所得固定化酶的活力隨加酶量的增加而增大；當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和后，增大加酶量不能增加固定化酶的活力。7pH值對(duì)固定化酶活力的影響游離酶的活性受pH的影響，pH還對(duì)酶分子的表面電荷有
7、影響，因此，pH可能對(duì)載體和酶的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生影響。8固定化反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響隨著固定化反應(yīng)時(shí)間的延長，固定化酶活力隨之增大；當(dāng)固定化反應(yīng)完成，載體上的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，再延長時(shí)間，固定化酶活力不變。9固定化條件優(yōu)化表一正交試驗(yàn)因素水平表因素水平1水平2水平3A戊二醛濃度（%）B酶液濃度（mg/mL）C交聯(lián)反應(yīng)pHD交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間0.150.56.03.00.251.07.04.00.351.58.05.0表二正交試驗(yàn)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD固定化酶活力固定化酶活力回收率123456789K1K2K3極
8、差R1112223331231231231232313121233122312
