項(xiàng)目四：香菇多糖的生產(chǎn)

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1、項(xiàng)目四：香菇多糖的生產(chǎn)任務(wù)1：香菇多糖制備方案的制定一、香菇多糖的概述1.香菇多糖（簡稱LNT），存在于香菇中，分子量為100萬，是從香菇中分離純化的一種葡聚糖，是以增強(qiáng)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能為主的免疫增強(qiáng)劑。與化療或放療聯(lián)用可發(fā)揮增效減毒作用。2.性質(zhì)：（1）外觀：白色或棕黃色粉末狀固體（2）穩(wěn)定性：對(duì)光和熱穩(wěn)定（3）溶解性：能溶于水，水溶液為中性，水中最大溶解度為3mg/ml,溶解度隨分子質(zhì)量增大而降低：帶有硫酸根或乙?；鶊F(tuán)的香菇多糖，其水溶性大大提高，不溶于甲醇、丙酮、高濃度乙醇等（4）旋光性：在不同的N

2、aOH溶液中有不同的旋光度（5）其他：香菇的主要成分是多糖類和不飽和脂肪酸，經(jīng)熱水提取的香菇多糖可調(diào)節(jié)人休內(nèi)有免疫功能的T細(xì)胞活性，可降低甲基膽蒽誘發(fā)腫瘤的能力。3.藥理作用：具有免疫增強(qiáng)作用，其機(jī)制在體內(nèi)雖無直接殺傷腫瘤細(xì)胞作用，但可通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤活性。在體內(nèi)能使脾臟和腹腔的NK細(xì)胞活性增強(qiáng)，誘生干擾素與本品劑量相關(guān)，其活性與白細(xì)胞介素類或干擾素誘導(dǎo)劑有協(xié)同作用。另有證明，在體外本品可增強(qiáng)脫氧胸腺嘧啶核苷的抗艾滋病毒的活性。 香菇多糖通過激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞毒（AD

3、DC），發(fā)揮抗腫瘤活性；此外，香菇多糖還能使腫瘤部位的血管擴(kuò)張和出血，導(dǎo)致腫瘤出血壞死和完全退化。 4.生物活性（1）香菇多糖的抗腫瘤活性（2）香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)（3）香菇多糖的抗病毒活性（4）香菇多糖抗感染作用二、實(shí)訓(xùn)目的1、掌握水溶醇沉法分離多糖類化合物的原理和方法。 2、掌握香菇多糖的含量測定三、實(shí)訓(xùn)原理1.在組織中，多糖多與蛋白質(zhì)以共價(jià)相結(jié)合，所以在生化產(chǎn)品制備工藝中，往往第一步多用酶降解蛋白質(zhì)部分或用堿使多糖—蛋白質(zhì)間的鍵裂開，以促進(jìn)多糖在提取時(shí)的溶解。堿性提取可避免多糖中硫酸基團(tuán)水解而破壞。現(xiàn)多采

4、用堿性提取的同時(shí)用蛋白質(zhì)水解酶處理組織。提取液中存在的蛋白質(zhì)可用普通蛋白質(zhì)沉淀劑使之沉淀，也可用其他方法使變性沉淀，如適當(dāng)調(diào)pH和加熱等。 2.本實(shí)驗(yàn)中性多糖常用水作溶劑來提取，可以用水浸煮。 3.香菇中色素較高，活性炭有脫色素、脫去異味等作用。 4.蛋白質(zhì)不溶于氯仿等有機(jī)溶劑，可對(duì)香菇多糖進(jìn)行除去雜蛋白。而香菇多糖在氯仿中溶解度大于在熱水中的溶解度，所以可以用氯仿對(duì)香菇多糖進(jìn)行萃取 5.乙醇沉淀法提取多糖時(shí)，乙醇的濃度及提取方式對(duì)多糖的得率影響較大。最有效的方法是向多糖溶液中加入乙醇，使乙醇的最終濃度依次達(dá)

5、到40%、60%、70%、80%，離心每次沉淀，乙醇沉淀得到的不一定是純的多糖，還需用凝膠柱色譜進(jìn)行分離純化。 6.用苯酚—硫酸法顯棕色，可以對(duì)多糖進(jìn)行定性檢測。 7.香菇子實(shí)體有含量較多的脂類的物質(zhì)，可以用石油醚、乙醚等低級(jí)性溶劑除去脂溶性雜質(zhì)。 8.因?yàn)橄愎饺赓|(zhì)太厚，萃取時(shí)氯仿很難滲透至其深處，則萃取物的產(chǎn)率低。熱水提取法多糖在260nm和280nm波長處有較明顯的吸收峰四、實(shí)訓(xùn)材料、儀器與試劑1.器材：組織搗碎機(jī)、恒溫水浴鍋、循環(huán)水式真空泵、冷凍離心機(jī)、凝膠柱、脫脂棉、再字夾、紫外分光光度計(jì)、容量瓶、

6、試管、燒杯、紫外檢測儀、記錄儀、流量泵 2.試劑：氯仿、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚-硫酸試劑：苯酚3g,濃硫酸5mL，溶于95mL無水乙醇中。 3.原料:香菇 五、實(shí)訓(xùn)步驟（一）多糖的提取1.熱水浸提：稱取香菇10g,于組織搗碎機(jī)內(nèi)粉碎，倒入燒杯中，加20倍量的水，將燒杯放入恒溫水浴鍋中90℃）加熱30min,然后用布氏漏斗和真空泵進(jìn)行抽濾，取濾液。2.脫色，除味：在濾液中加入活性炭（1mg/ml），攪拌吸附1h，抽濾，取濾液。3.萃取、除雜蛋白：在濾液中加入氯仿溶液，充分混合后，過濾，取濾液。重復(fù)萃取、除雜

7、3次。4.乙醇沉淀：在萃取液中加入無水乙醇，使其乙醇濃度達(dá)80%，沉淀12h,于冷凍離心機(jī)（4000r/min）離心30min，取沉淀5.脫脂：沉淀物分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，即得香菇多糖提取物。（二）多糖純化取上述香菇多糖提取物溶于蒸餾水中，離心除去不溶物。SephadexG100凝膠裝好柱，用蒸餾水平衡48h,然后將上清液上柱分離，用蒸餾水洗脫，洗脫速度5ml/20min（可用恒流泵控制洗脫速度）,200nm波長紫外檢測，收集主要峰部分（當(dāng)記錄儀上出現(xiàn)波峰時(shí)即用試管開始收集洗脫液），冷凍干燥得白

8、色香菇多糖，并稱重。（三）香菇多糖分析檢測1．定性檢測—苯酚-硫酸法將苯酚-硫酸試劑噴灑在冷凍干燥好的白色香菇多糖上110℃，加熱香菇多糖幾分鐘，顯棕色即為多糖。2.定量檢測---分光光度法a.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取(可用分析天平）60℃干燥至恒重的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1g，置于100ml的容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度處。用移液管量取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0ml.分別置50m