特異性抗細(xì)胞表面分子單鏈抗體的分離和鑒定

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1、特異性抗細(xì)胞表面分子單鏈抗體的分離和鑒定作者：許靜吳立華徐潔劉俊霞孟磊何一心宋增璇【摘要】目的：從抗KG1a細(xì)胞的噬菌體展示文庫中分離和鑒定抗造血干/祖細(xì)胞表面分子單鏈抗體，克隆其基因并研究其對應(yīng)抗原在不同細(xì)胞表面的分布。方法：用完整的KG1a細(xì)胞吸附法富集文庫3輪，再用CD44單克隆抗體為引導(dǎo)分子進(jìn)行引導(dǎo)選擇，分離單克隆后用間接免疫熒光法鑒別其細(xì)胞結(jié)合特異性。對具有不同細(xì)胞結(jié)合特異性的克隆進(jìn)行DNA序列分析，用一級結(jié)構(gòu)不同的單鏈抗體作免疫印跡鑒別抗原分子量。結(jié)果：間接免疫熒光結(jié)果顯示，64個陽性克隆分別識別不同的細(xì)胞系，分屬3種細(xì)胞結(jié)合譜，DNA序列測定結(jié)果證明C95、H

2、1兩個克隆具有獨特的一級結(jié)構(gòu)，利用Westernblot成功測定它們特異性識別KG1a細(xì)胞膜蛋白的表觀分子量分別為34kD/22kD。結(jié)論：成功建立了分離和鑒定抗細(xì)胞表面分子phagescFv單克隆的方法，并從抗KG1a細(xì)胞的噬菌體展示文庫中分離出2個抗造血干/祖細(xì)胞的特異性克隆?！娟P(guān)鍵詞】噬菌體展示引導(dǎo)選擇表面分子單鏈抗體Isolationandidentificationofspecificsingle10/10chainantibodiesagainstcellsurfacemolecules［Abstract］Objective:Isolationandident

3、ificationofsinglechainantibodiesagainstsurfacemoleculesofhematopoieticprogenitorcellsviaphagedisplayantibody:AninpidualKG1a+phagescFvlibraryforthebindingspecificitytoeighthematopoieticprogenitorcelllinesbyindirectimmunofluroresceinwereidentified.Then,themonoclonalityofthescFvswasprovedbyt

4、estingspecificbindingtoantigenproteinsbyWestern:64KG1a+phagescFvswereidentified.Theyshowedthreekindsofcellbindingrepertoire.TheuniqueprimarystructuresoftwophagescFvcloneswereprovedbyDNAsequence.TheirrecombinantscFvSAfusionproteinsboundtothesinglebandofproteinsfromKG1acellswithmolecularw

5、eightsof34kDand22kD,:ReliablemethodstoidentifyphagescFvclonesagainstcellsurfacemoleculeshavebeenestablishedandobtainedtwouniquephage-scFvclonesagainsthematopoieticprogenitorcellsurfacemoleculesfromanantiKG1acellphagescFvlibrary.10/10［Keywords］Phagedisplay;Pathfinderselection;Surfacemole

6、cule;ScFv　　免疫球蛋白的可變區(qū)是抗體識別和結(jié)合抗原的功能區(qū)，其分子量只有全抗體的1/5左右，由于分子量小、組織穿透力強，因此由抗體可變區(qū)構(gòu)成的單鏈抗體具有體內(nèi)良好的應(yīng)用前景，也是構(gòu)建成各種雙功能抗體的基本單位[1]。近年快速發(fā)展的噬菌體表面展示抗體技術(shù)日益成為制備單克隆抗體的有效手段，如何從包含眾多非特異性和未知特異性的文庫中分離特異性單克隆phagescFv，涉及到篩選策略選擇和多項技術(shù)的應(yīng)用。本研究的目的在于尋找新的有功能的抗造血干/祖細(xì)胞表面分子的抗體，并通過所獲得的抗體分離抗原分子及其基因，我們探索了從自建的噬菌體抗體庫中分離和鑒定特異性單克隆phage

7、scFv的方法，對分離的特異性單克隆scFv進(jìn)行表達(dá)鑒定，這對于進(jìn)一步研究抗造血/干祖細(xì)胞表面分子和發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞表面分子具有一定的意義[2]?！　?材料與方法材料10/10抗KG1a細(xì)胞噬菌體展示文庫由本室構(gòu)建[3]；NHS生物素和鏈霉親和素磁珠購自Pierce公司；抗M13單抗購自pharmacia公司；抗CD44單抗和兔抗小鼠IgGFITC購自協(xié)和干細(xì)胞公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠F2{HRPF2}購自ProtosImmunoresearch公司；表達(dá)載體pSTE2、輔助噬菌體M13KO7和XL1