特異性抗細(xì)胞表面分子單鏈抗體的分離和鑒定

《特異性抗細(xì)胞表面分子單鏈抗體的分離和鑒定》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、特異性抗細(xì)胞表面分子單鏈抗體的分離和鑒定作者：許靜吳立華徐潔劉俊霞孟磊何一心宋增璇【摘要】目的：從抗KG1a細(xì)胞的噬菌體展示文庫中分離和鑒定抗造血干/祖細(xì)胞表面分子單鏈抗體（scFv），克隆其基因并研究其對應(yīng)抗原在不同細(xì)胞表面的分布。方法：用完整的KG1a細(xì)胞吸附法富集文庫3輪，再用CD44單克隆抗體為引導(dǎo)分子進(jìn)行引導(dǎo)選擇，分離單克隆后用間接免疫熒光法鑒別其細(xì)胞結(jié)合特異性。對具有不同細(xì)胞結(jié)合特異性的克隆進(jìn)行DNA序列分析，用一級結(jié)構(gòu)不同的單鏈抗體作免疫印跡鑒別抗原分子量。結(jié)果：間接免疫熒光結(jié)果顯示，64個陽性克隆分別識別不同的細(xì)胞系，分屬3種細(xì)胞

2、結(jié)合譜，DNA序列測定結(jié)果證明C95、H1兩個克隆具有獨(dú)特的一級結(jié)構(gòu)，利用ethods:AnindividualKG1a+phagescFvlibraryforthebindingspecificitytoEighthematopoieticprogenitorcelllinesbyindirectimmunoflurorescEInonoclonalityofthescFvsarystructuresoftKG1acellsolecularethodstoidentifyphagescFvclonesagainstcellsurfacemo

3、leculeshavebeenestablishedandobtainedtatopoieticprogenitorcellsurfacemoleculesfromanantiKG1acellphagescFvlibrary.［Keyolecule;ScFv　　免疫球蛋白的可變區(qū)是抗體識別和結(jié)合抗原的功能區(qū)，其分子量只有全抗體的1/5左右，由于分子量小、組織穿透力強(qiáng)，因此由抗體可變區(qū)構(gòu)成的單鏈抗體（Singlechainantibodyfragments,scFv）具有體內(nèi)良好的應(yīng)用前景，也是構(gòu)建成各種雙功能抗體的基本單位[1]。近年快速發(fā)展

4、的噬菌體表面展示抗體技術(shù)日益成為制備單克隆抗體的有效手段，如何從包含眾多非特異性和未知特異性的文庫中分離特異性單克隆phagescFv，涉及到篩選策略選擇和多項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。本研究的目的在于尋找新的有功能的抗造血干/祖細(xì)胞表面分子的抗體，并通過所獲得的抗體分離抗原分子及其基因，我們探索了從自建的噬菌體抗體庫中分離和鑒定特異性單克隆phagescFv的方法，對分離的特異性單克隆scFv進(jìn)行表達(dá)鑒定，這對于進(jìn)一步研究抗造血/干祖細(xì)胞表面分子和發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞表面分子具有一定的意義[2]?！　?材料與方法　　1.1材料　　抗KG1a細(xì)胞噬菌體展示文庫由本

5、室構(gòu)建[3]；NHS生物素和鏈霉親和素磁珠購自Pierce公司；抗M13單抗購自pharmacia公司；抗CD44單抗和兔抗小鼠IgGFITC購自協(xié)和干細(xì)胞公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠F(ab)2{HRPF(ab)2}購自ProtosImmunoresearch公司；表達(dá)載體pSTE2、輔助噬菌體M13KO7和E.coliXL1Blue由德國海德堡大學(xué)Dubel博士惠贈；HL60、U937、CEM、Jurkat、NALM6、BJAB、HEL、Meg01等細(xì)胞系由本室保存?zhèn)溆茫幌拗菩詢?nèi)切酶、連接酶等購自Invitrogen公司。　　

6、1.2phagescFv文庫的富集和引導(dǎo)選擇　　參見　　2.2KG1a+phagescFv單克隆對其他細(xì)胞系的識別　　64個陽性單克隆分別與8個造血祖細(xì)胞階段細(xì)胞系做間接免疫熒光反應(yīng)，其中41個單克隆與8個細(xì)胞系均呈陽性反應(yīng)，15個單克隆識別7個細(xì)胞系而不識別BJAB細(xì)胞系，8個單克隆與8個細(xì)胞系均呈陰性反應(yīng)（表1）。結(jié)果顯示有3種類型scFv，它們的細(xì)胞結(jié)合譜為9（+）、8（+）1（-）和1（+）8（-）。表1phagescFv的細(xì)胞結(jié)合譜（略）　　2.3phagescFv單克隆的DNA序列分析　　從與細(xì)胞結(jié)合譜不同的phagescF

7、v中分別挑取2個克隆作DNA序列測定。測序結(jié)果按Kabat編號標(biāo)明scFv核苷酸排列順序及其演繹的氨基酸殘基排列順序，比較各個scFv的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）[6]。結(jié)果3個克隆的DNA序列與以前報導(dǎo)的C4、C131和C193相同；1個克隆的互補(bǔ)決定區(qū)與以前報導(dǎo)的C194相差2個氨基酸殘基；2個克隆C95、H1的DNA序列完全不同于以前報導(dǎo)（表2，3）[4]。表2scFv克隆的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸殘基序列（略）表3scFv克隆的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸殘基序列（略）　　2.4免疫印跡結(jié)果分析　　免疫印跡結(jié)果顯示scFvSAC95和scFvSAH

8、1融合蛋白能識別和結(jié)合KG1a細(xì)胞膜蛋白中的抗原帶，它們的表觀分子量分別約為34、22kD（圖2）。　　3討論細(xì)胞表面分子是鑒別細(xì)胞種類