兩種常用纖維素酶活力測定方法---濾紙酶活-cmc酶活

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1、檢測纖維素酶酶活力—濾紙酶活力(FPA)濾紙酶活力代表了纖維素酶的三種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。采用3，5一二硝基水楊酸法測定酶活：(簡稱DNS法)1、原理：纖維素經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，還原糖能將3，5一二硝基水楊酸中硝基還原成氨基，溶液變?yōu)槌壬陌被衔铮矗?一氨基一5二硝基水楊酸，在一定的還原糖濃度范圍內(nèi)，橙色的深度與還原糖的濃度成正比，據(jù)此可以推算出纖維素酶的活力。2、采用的濾紙酶活單位定義：濾紙酶活反映了纖維素酶的3種水解酶，即內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶組成的誘導(dǎo)復(fù)合酶系的協(xié)

2、同水解纖維素能力。是該菌株整個纖維素酶系的酶活力水平的綜合體現(xiàn)。代表了纖維素酶的三種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。在此濾紙酶活單位定義為：以濾紙為底物，在一定反應(yīng)條件(pH4.8，50℃，恒溫lh)下，以水解反應(yīng)中，1ml纖維素酶液1min催化纖維素生成lug葡萄糖為1個濾紙酶活單位，以U表示。3、濾紙酶活力(FPA)的測定：①　取0．5ml適當(dāng)稀釋的酶液，加入PH值為4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液lml或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液lml；②　再加入50±0.5mg濾紙(1cmx6cm)一條，于50℃保溫

3、酶解反應(yīng)1小時，(先預(yù)熱5分鐘)；③　加入DNS顯色液3ml(標(biāo)準(zhǔn)曲線用量是1.5ml)，放入已沸騰的水中沸水浴lOmin，流水冷卻后在540nm下測吸光度；④　同時用100℃煮沸l(wèi)Omin后失活的酶液做對照，扣除本底；⑤　根據(jù)吸光度從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖克數(shù)計算出酶活值。濾紙酶活按下面公式計算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:為濾紙酶酶活力，單位U／mL。W：為從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖的濃度。N：為酶液稀釋總倍數(shù)。T：為反應(yīng)時間。M：為樣品的體積。4、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)

4、曲線繪制方法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取25ml具塞刻度試管6支，加入1.0mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸餾水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS試劑1.5ml，混勻后在沸水浴中加熱5分鐘，取出立即用冷水冷卻，用水定容至25ml，搖勻，測吸光度A，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、3，5二硝基水楊酸（DNS）試劑稱取6.3克3,5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸鉀鈉，加500ml水，加熱溶解后再

5、加入5.0克重蒸酚和5.0克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。纖維素酶活力的測定——CMC糖化力法1、定義：1毫升液體酶（或1克固體酶粉），在40℃pH﹦4.6條件下，每分鐘水解羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），產(chǎn)生1.0ug的葡萄糖，即為1個酶活單位，以u/g（u/ml）表示。2、原理：CMC-Na在纖維素酶的作用下,水解產(chǎn)生纖維寡糖、纖維二糖、葡萄糖等還原糖，還原糖能將3，5﹣二硝基水楊酸中的硝基還原成橙黃色的氨基化合物，在540nm波長下測定吸光度值A(chǔ)，吸光度與酶活

6、成正比。CMC-Na糖化力主要代表內(nèi)切β-1.4-葡聚糖的活力。3、試劑：3.10.1mol/LpH﹦4.6醋酸﹣醋酸鈉緩沖溶液：將49.0ml0.2mol/L醋酸鈉溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸餾水。注意：0.2mol／L醋酸鈉溶液：稱取27.22g結(jié)晶乙酸鈉（AR）定容至1000ml。0.2mol／L醋酸溶液：稱取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。3.23，5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.3克3,5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石

7、酸鉀鈉，加500ml水，加熱溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。3.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0mg/ml）：稱取1.000克葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸餾水溶解后定容至1000ml，冰箱保存?zhèn)溆谩?.4羧甲基纖維素鈉溶液：稱2.0gCMC-Na溶于200ml蒸餾水中，加醋酸緩沖溶液100ml,混勻后存于冰箱內(nèi)備用。配后隔天使用。4、分析步驟：4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取25ml具塞刻度試管6支，加入1.0mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0

8、.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸餾水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS試劑1.5ml，混勻后在沸水浴中加熱5分鐘，取出立即用冷水冷卻，用水定容至25ml，搖勻，測吸光度A，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.2待測酶液制備：準(zhǔn)確稱取酶粉1.0克置研缽中，加入pH4.6的醋酸緩沖溶液少量溶解，研細(xì)，將上清液小心傾入25