細(xì)生實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)要點(diǎn)

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1、細(xì)生實(shí)驗(yàn)復(fù)習(xí)要點(diǎn)First：3個(gè)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一：光學(xué)顯微鏡的使用方法使用顯微鏡時(shí)的注意事項(xiàng)1.拿顯微鏡時(shí)應(yīng)右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，不能用一手隨便斜提，以防目鏡從鏡筒滑出和反光鏡脫落。2.顯微鏡用完后，必須將目鏡、物鏡、反光鏡等用清潔的擦鏡紙或綢布輕輕擦拭，切勿口吹、手摸或用粗布擦拭，勿用乙醇及其他藥物擦拭，以免侵蝕鏡臺(tái)或鏡頭。3.使用顯微鏡應(yīng)先用低倍鏡調(diào)節(jié)光源，如觀察組織細(xì)胞或染色較淺標(biāo)本時(shí)，要適當(dāng)關(guān)小光圈，使物像清晰。4.放置標(biāo)本玻片時(shí)，應(yīng)將有蓋玻片的一面朝上，用標(biāo)本夾輕輕夾住玻片的兩端，要把要觀察的部分對(duì)

2、準(zhǔn)通光孔的正中央。如果玻片標(biāo)本放反了，不僅不易找到物象，并且容易壓碎玻片，損傷物鏡。5.觀察時(shí)要兩眼齊睜，用左眼從目鏡中尋找物像，仔細(xì)觀察，用右眼看紙繪圖。使用低倍鏡用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)物距，使用高倍鏡必須用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)物距。粗細(xì)調(diào)節(jié)器都不能做單方向的旋轉(zhuǎn)，如一直上升粗調(diào)節(jié)器會(huì)使鏡筒脫落。反之，如一直下降會(huì)壓碎玻片。6.不要隨意取出物鏡，以防灰塵落入。禁止任意拆卸任何零件，以防意外損失。7.顯微鏡用完后，應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使鏡筒徐徐上升，取下玻片，并轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤(pán)，使物鏡離開(kāi)聚光鏡，下降鏡筒使物鏡接近鏡臺(tái)，再裝入箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)二：動(dòng)物染

3、色體的制備重點(diǎn)掌握：秋水仙素的作用抑制紡錘體的形成，從而使有絲分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。選用小鼠骨髓細(xì)胞的原因：骨髓細(xì)胞數(shù)量多，分裂旺盛，不需體外培養(yǎng)和無(wú)菌操作，便于取材。固定液：3:1甲醇-冰醋酸有固定作用，對(duì)染色體還有一定的分散作用。Giemsa染液將細(xì)胞核染成紫紅色實(shí)驗(yàn)三：蟾蜍血細(xì)胞的體外融合重點(diǎn)掌握：PEG（聚乙二醇）的作用過(guò)程：PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體，具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白質(zhì)的作用。PEG可改變各類(lèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處脂類(lèi)分子發(fā)生疏散和重組，引

4、起細(xì)胞融合。融合的頻率和活力與所用PEG的相對(duì)分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間、細(xì)胞的生理狀態(tài)與密度等有關(guān)。試驗(yàn)中終止PEG作用的方法：緩慢向離心管中加入5mlHanks溶液，輕輕吹打混勻，于37度水浴中靜置5min.異種細(xì)胞融合的意義：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，在雜交育種方面有重要意義。所用染液：詹姆斯綠染液Second：2個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一：鼠肝基因組DNA的提取與純化實(shí)驗(yàn)原理：DNA是染色體的主要組成成分，是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。DNA在生物組織中往往以核蛋白的形式主要存在于細(xì)胞核中，分子量甚大。提取DNA最基本的要求是保

5、持DNA大分子的完整性以及純度，避免機(jī)械張力（剪切）引起DNA分子的降解，注意對(duì)雜質(zhì)及蛋白質(zhì)的去除，防止細(xì)胞內(nèi)存在的DNA酶對(duì)DNA的酶解。本實(shí)驗(yàn)用蛋白酶K及SDS在EDTA存在的條件下，裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚并使細(xì)胞內(nèi)存在的DNA酶失活，然后用苯酚-氯仿有機(jī)溶劑多次抽提后，用透析或乙醇沉淀得到純化的DNA。試劑作用：Tris-Cl(pH7.8):維持pH恒定，防止DNA變性和水解EDTA（乙二胺四乙酸）：絡(luò)合二價(jià)金屬離子，當(dāng)Mg2+被絡(luò)合后細(xì)胞內(nèi)釋放出的DNA酶的作用被抑制，避免DNA的降解；同時(shí)金屬離子

6、絡(luò)合后，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性下降，有利于膜的裂解。SDS（十二烷基磺酸鈉）：使蛋白質(zhì)變性，破壞膜蛋白的構(gòu)象，使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸與蛋白質(zhì)解離，并且也具有抑制DNA酶的作用。苯酚-氯仿混合液（分層，吸取苯酚）：使蛋白質(zhì)變性思考題：1從生物細(xì)胞中提取DNA的主要注意點(diǎn)是什么？應(yīng)如何控制？注意點(diǎn)：盡量保持DNA大分子的完整性及純度，防止各種物理、化學(xué)、生物的影響?？刂疲孩艅?dòng)作要輕柔，使用鈍口滴管，以防止外界機(jī)械性損傷⑵控制適宜的溫度和pH，以防止DNA雙鏈氫鍵斷裂，變性⑶使用RNase(RNA水解酶）、低溫、EDTA，

7、防止DNA降解⑷樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子⑸降低其他生物大分子的污染至最低⑹排除其他核酸分子的干擾2能引起DNA分子變性的因素有哪些?DNA降解和DNA變性有何區(qū)別？如何鑒別？因素：加熱、極端的pH、有機(jī)試劑如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等區(qū)別：DNA變性是氫鍵的斷裂，是可逆的，對(duì)理化性質(zhì)的影響如增色效應(yīng)、粘度降低等；DNA降解是破壞磷酸二酯鍵，不可逆，會(huì)使分子量降低。鑒別：電泳DNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色后，在紫外光激發(fā)下，DNA分子會(huì)產(chǎn)生橘黃色熒光，根據(jù)條帶所在位置，可判斷DN

8、A分子的大小實(shí)驗(yàn)二：PCR技術(shù)檢測(cè)β-actin基因原理要掌握（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告P28）反應(yīng)中各體系的作用：Tris-HCl:提供穩(wěn)定的pH=8.3的環(huán)境模板DNA：為復(fù)制提供精確的模板dNTP：提供原料Tap-DNA聚合酶：提供動(dòng)力KCl：有利于復(fù)性，使引物連接上去Mg2+：DNA聚合酶的輔酶BSA（牛血清白蛋白）：穩(wěn)定劑溴酚藍(lán)：示蹤