高效液相色譜法測定化學合成生物多肽的心得

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1、多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是藥物開發(fā)的一個主要方向。80年代中期至今多肽化學合成技術(shù)有很大發(fā)展，合成的成品一般是以目標多肽為主的幾種結(jié)構(gòu)相似多肽的混合物，對多肽混合物的分離分析及純度鑒定一直是一個重要問題。本文主要介紹本人在分析多肽類化合物過程中的一些心得和經(jīng)驗.首先，在色譜柱選擇方面，因為多肽的分子量較大（一般在幾千到幾萬），分子量在10000左右的，常用的C18柱分離效果不太好，要選用碳鏈比較短的色譜柱，如：C8或者C4；填料孔徑不能選普通的100埃，要選孔徑比較大的如300埃等。分子量在幾萬或者幾十萬的，可以選體積排阻色譜，

2、用凝膠色譜柱。其次，在用反相色譜柱時，因為多肽是由氨基酸組成的，流動相選擇一般用含0.1%的三氟乙酸水和含0.1%的三氟乙酸乙腈的梯度洗脫。但因為多肽類化合物的紫外吸收較弱，檢測波長一般選在200~210nm左右，所以空白梯度的基線會往上漂移很多，特別是樣品濃度比較小的時候，分析誤差較大?？紤]乙腈的本底吸收比水大，在梯度洗脫過程中，隨著乙腈比例的增大，基線會向上漂。因此把乙腈中的三氟乙酸濃度降為0.05%~0.07%（可以隨梯度不同選不同濃度），通過兩者紫外吸收的抵消，基線變得平穩(wěn)很多，同時能增加檢測的靈敏度，使分析更靈敏、更準確。第三，合成的多肽中的雜質(zhì)一般與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，

3、極性相差無幾，分離難度較大，在選擇洗脫梯度時要細心一點，多做一些試驗，最好要做主峰的純度掃描，盡量把雜質(zhì)完全分開，對于難分離的多肽，可以選長一點的色譜柱或者延長梯度洗脫的時間。還有最后一招，如果按以上方法分離還是不太好的話，可以適當?shù)奶岣咧鶞?，我們有一品種就是這樣的，當柱溫升到60度時，塔板數(shù)和與雜質(zhì)的分離度都能得到一定的改善。HPLC分析柱有兩類：離子交換柱和反相柱。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用，柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷，分離是一種電荷相互作用，通過改變PH值、離子強度，達到分離純

4、化的效果。通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽從柱中洗脫出?！　》聪郒PLC條件與正常層析正相反，多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構(gòu)成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的，高帶電肽好；另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好?！　〉湫偷牟僮鞒Ｓ蓛删R沖劑組成，0.1%TFA-H2O和80%acetonitrile0.1%TFA--H2O稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm

5、(3-10μm)和22×250mm(10μm).如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10μm）和25×250mm(10μm)　　大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀Heformic酸(5-6%,pH2-4),10-100mMNH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH，因為這樣會破壞柱子一般多肽分離拿150mm的柱子就可以了，250mm在分離度上改善不大，因為多肽的分離機理和小分子不同。小分子是通過液液交換，

6、所以柱子越長交換越充分，分離度也越高。多肽在柱子上的保留和分離其實主要發(fā)生在柱頭，也就是說，多肽先在柱頭都被保留下來，隨著梯度上升逐漸被洗脫，所以柱長對多肽分離的影響比起其對小分子的分離度影響小得多。建議去找一下VydacGrace出的一本關(guān)于多肽分離的小冊子，很有幫助。