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1、溶液中蛋白質(zhì)含量的測定學案【實驗分析】應用分光光度計等測試儀器定量測定食物中營養(yǎng)物質(zhì)的含量，是中學生物實驗技術的升級。它不僅讓學生感悟到生物學研究技術早就進入科學精準測量時代，而且可以讓學生知道自己在課堂中學會的實驗技術可以應用到日常生活中，感受學習的樂趣?！叭芤褐械鞍踪|(zhì)含量的測定”是上海市高中《生命科學》教材第一冊中有關蛋白質(zhì)含量測定的定量實驗，也是高中第一個定量的生物學實驗。【實驗原理】1.雙縮脲反應：雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經(jīng)180攝氏度左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫
2、色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或通過一個中間碳原子相連的肽鍵的化合物都有雙縮脲反應。而蛋白質(zhì)有兩個以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關。2.標準曲線：定量實驗是建立在定性試驗的基礎之上，需要純物質(zhì)作為標準樣品。標準曲線法是常用的定量方法，該方法需要配制一組不同濃度的標準溶液，分別測出它們的吸收度，然后以標準濃度（C）為橫坐標，以吸收度（A）為縱坐標，即可繪出標準曲線圖，曲線為一通過原點的直線。待測溶液亦經(jīng)
3、過同樣處理，測出它的吸收度，即可從標準曲線查出樣品的濃度，再由稀釋倍數(shù)或樣品重量求出樣品中被測組分的含量。優(yōu)點：繪制好標準工作曲線后測定工作就變得相當簡單，可直接從標準工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。缺點：每次樣品分析的條件很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。此外，標準工作曲線繪制時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），而實際樣品的組成卻千差萬別，因此必將給測量帶來一定的誤差，所以要注意實驗的重復性問題。3.本實驗中將結(jié)晶牛血清白蛋白配制成（0—2.5）mg/mL不同濃度的標準溶液，通過分光光度計或者色度傳感
4、器測出它們的吸收度，繪制標準曲線，并通過標準曲線計算待測溶液中的蛋白質(zhì)含量?！緦嶒災繕恕?.知識目標：能概述雙縮脲反應的原理，并簡要說出標準曲線法的原理和優(yōu)缺點2.能力目標：能照使用方法正確使用刻度移液管；能初步使用分光光度計；能利用儀器所測得的數(shù)據(jù)正確繪制標準曲線，并通過所繪曲線及公式正確計算出待測溶液的蛋白質(zhì)含量3.情感態(tài)度與價值觀：學生能體會到真實記錄實驗數(shù)據(jù)和積極、善于分析的科學實驗態(tài)度和精神，并在日后的實驗或?qū)W習過程中踐行之?！緦嶒灢牧吓c器具】1.實驗材料：結(jié)晶牛血清白蛋白，待測樣品（稀釋100-150倍的雞蛋清，稀釋100-200
5、倍的豆?jié){）2.實驗試劑：CuSO4·5H2O,酒石酸鉀鈉，10%氫氧化鈉，蒸餾水3.實驗儀器：分光光度計，試管，試管架，1ml與5ml的刻度移液管，玻璃棒，250ml燒杯，10ml容量瓶，記號筆【實驗過程】1.蛋白標準溶液和雙縮脲試劑的配置：稱取結(jié)晶牛血清白蛋白25mg，溶解于蒸餾水并定容至10ml，制成2.5mg/ml濃度的牛血清白蛋白標準溶液；0.75g五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）和3.0g酒石酸鉀鈉，用250ml蒸餾水溶解，在攪拌下加入150ml氫氧化鈉溶液，用水稀釋到500ml即得雙縮脲試劑，可長期儲存于塑料瓶或內(nèi)涂有石蠟的試劑
6、瓶中。2．取7支試管，從0依次編號。3．按照下表在試管0-5中加入牛血清白蛋白標準液及蒸餾水，在試管6中加入待測液1ml。4．每只試管加入4ml雙縮脲試劑。5．靜置20min，以蒸餾水為空白對照，在540nm波長下測定各試管中樣品的吸光強度，記錄O.D值。6．以O.D值為縱坐標，蛋白質(zhì)含量為橫坐標繪制標準曲線。7．根據(jù)試管6測得的O.D值，從標準曲線中查出其中的蛋白質(zhì)含量。8．蛋白質(zhì)含量的計算：蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=D*N。D-從標準曲線上查出的蛋白質(zhì)含量；N-稀釋倍數(shù)?！緦嶒炚f明】1.安排：鑒于時間與空間的關系，屆時每組派一名同學共4名
7、完成標準曲線的實驗（0-5號試管溶液的添加），并用excel制作標準曲線；其余每組同學可根據(jù)自己的需要選擇不同稀釋濃度（100-150之間）的雞蛋清或豆?jié){（有興趣的同學當天可自帶材料探索，如牛奶等）。2.注意事項：1）使用分光光度計時，請務必確認是在540nm下，使用中輕拿輕放，愛護實驗儀器；每只試管重復測三次2）因待測蛋白質(zhì)稀釋溶液需在0.25-2.5mg之間，自帶材料濃度未知的屆時需稀釋多個梯度濃度以確定合適的可測范圍，本組提供的材料是經(jīng)過多次實驗探索到的可測蛋白質(zhì)含量的稀釋濃度，請放心使用3）操作過程務必嚴謹，稍不注意易導致實驗失敗。3
8、．知識拓展：1）經(jīng)前人實驗的不斷探究，添加酒石酸鉀鈉配置的雙縮脲試劑不僅較“先加5%NaOH后加1%CuSO4”更能增強實驗的靈敏度和結(jié)果的穩(wěn)定性，且其可以在塑料瓶
