中藥聯(lián)合褪黑激素對帕金森模型大鼠前腦紋狀體細胞凋亡和行為學的影響

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1、中藥聯(lián)合褪黑激素對帕金森模型大鼠前腦紋狀體細胞凋亡和行為學的影響作者：嚴麗榮周亞平苗曼悌王林仙徐金張曄周志強劉益仁狄榮科【摘要】目的觀察中藥(平顫方)聯(lián)合褪黑激素（MT）對帕金森病(PD)模型大鼠行為學和前腦紋狀體細胞凋亡的影響，探討中藥聯(lián)合MT治療PD的作用及其機制。方法SD大鼠60只，分5個組：空白對照組、模型對照組、MT組、中藥組、中藥+MT組。模型對照組和各治療組大鼠腹腔注射N甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶（MPTP）建立PD模型，用爬桿法和迷宮試驗測量大鼠行為學改變和智力狀況，Bax/Bcl2免疫組織化學染色和T

2、unel法檢測前腦紋狀體凋亡細胞。結果PD大鼠出現(xiàn)不同程度爬桿能力下降和智力減退；與病理對照組相比，用藥實驗組尤其是中藥+MT組大鼠行為學異?？刹糠只蛉扛纳疲≒＜0.05），前腦紋狀體神經元和膠質細胞Bcl2蛋白表達明顯增強（P＜0.01），Bax基因表達受抑制（P＜0.01），同時前腦黑質紋狀體通路細胞凋亡減少（P＜0.01）。結論中藥平顫方聯(lián)合MT通過抗氧化應激途徑，激活Bax/Bcl2系統(tǒng)，調節(jié)前腦黑質紋狀體通路多巴胺（DA）神經活性，抑制細胞凋亡和改善PD癥狀?！娟P鍵詞】中藥平顫方；褪黑激素；N甲基4苯基1,2,3

3、,6四氫吡啶；細胞凋亡；帕金森病10帕金森病(PD)在中醫(yī)學中屬于“顫證、顫振”范疇，中老年人肝腎虧虛，髓海不足，虛風內動是本病發(fā)病之源〔1〕。臨床應用左旋多巴替代內源性多巴胺(DA)的缺乏，可改善PD癥狀，但大多數(shù)病人服藥一段時間后療效減退，出現(xiàn)運動障礙、智力減退和精神癥狀等副作用。根據(jù)中醫(yī)對PD的認識并結合臨床經驗擬定中藥平顫方，觀察中藥聯(lián)合褪黑激素（MT）對前腦紋狀體細胞凋亡的影響及功能的改善，探討其聯(lián)合治療PD的作用及機制?！　?對象與方法　　1.1對象　　雄性SD大鼠，體重255～305g（鼠齡6～8w），由江蘇大學醫(yī)學院實

4、驗動物中心提供。動物自由進食飲水，光照12/12h明暗交替，室溫飼養(yǎng)。用爬桿法進行篩選：引導動物在10s內自桿頂爬至桿底，每只訓練4次，訓練完畢對其進行測定，選取正常（0分）大鼠進入實驗，隨機抽取12只作空白對照組，其余作建模處理。將MPTP用生理鹽水配制，濃度為30mg/ml，30mg/kg腹腔注射，每日1次，共7d。再用爬桿法進行篩選，篩選4810只PD模型(1.5～2.0分)大鼠進入實驗；隨機抽取36只作為治療組（中藥組、MT組、中藥組+MT組，每組12只），其余12只作模型對照組?？偣踩脒x大鼠60只，每組均為12號?！　?.2方

5、法　　各治療組和模型對照組大鼠于末次注射MPTP及用藥/水后7、14、21d，進行爬桿試驗，每只大鼠允許爬桿3次，計算平均分。爬桿實驗用直徑35mm、高1000mm的光滑不銹鋼管，垂直豎立，將大鼠頭向下放置在金屬桿的頂部，使其沿桿自然爬下，觀察動物在下行過程中的行為，并按標準計分，評分標準如下：四肢并用，一次順利從桿上爬下為0分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為的為0.5分；上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下，但可抱緊金屬桿為1分；滑行后掉落為1.5分；不能抓桿，直接掉落為2.0分。同時對所有動物進行“T”形迷宮實驗，測定動物智力狀況，每只

6、大鼠走迷宮3次，計算平均錯誤次數(shù)。　　1.2.1中藥配方及治療　　中藥平顫方由黃芪、天麻、銀杏葉、白芍、鉤藤、連翹、生甘草、野生葛根、大葉紅景天、黃連等組成，制成濃縮煎劑。每日20:00胃飼中藥除平顫方煎劑3ml（相當于中藥10g），同時腹腔注射MT10mg/kg，連續(xù)治療21d；模型對照組，每日同時胃飼3ml生理鹽水和腹腔注射110ml生理鹽水。MT（Sigma公司產品）使用前先用無水乙醇溶解，然后加生理鹽水稀釋，MT初始濃度為3mg/L,使用前調至所需終濃度，其中無水乙醇濃度小于0.5％(V/V)。　　1.2.2取材和切片制備　　各

7、組動物分別于末次注射MPTP后用藥/生理鹽水治療7、14、21d,用10%水合氯醛麻醉，0.9%生理鹽水150ml經心臟快速灌注沖洗，再用4.0%多聚甲醛200ml灌注。取右側半腦，10%甲醛固定48h以上。以松果體為標志，向頭側橫向切取3段，每段厚2mm，前段為紋狀體最大分布區(qū)。石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm，取4套切片，分別用于HE染色，Bax/Bcl2免疫組織化學染色和Tunel法細胞凋亡染色?！　?.2.3Bax/Bcl2免疫組織化學染色　　采用SP法，兔抗鼠Bax、Bcl2抗體及生物素羊抗兔IgG（購于武漢博士德生物技術

8、公司）。切片脫蠟后，用3%甲醇過氧化氫孵育20min，將切片置于10%牛血清蛋白30min，分別在切片上加入Bax、Bcl2（1∶200）抗體，在溫箱內過夜。次日加生物素IgG（1∶100）37℃反應30