促大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的研究

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1、促大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的研究　　【摘要】目的探討成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的體外培養(yǎng)和向神經(jīng)元樣細胞分化的方法。方法通過梯度分離獲得成年大鼠MSCs,在細胞因子和氧化劑作用下對其誘導分化為神經(jīng)元樣細胞,免疫細胞化學方法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)巢蛋白(Nestin)的表達情況，流式細胞儀檢測分析誘導率。結(jié)果BMSCs被轉(zhuǎn)化神經(jīng)元樣細胞并表達Nestin。應用堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、叔丁基對羥基茴香醚（BHA）所獲得的神經(jīng)元樣細胞誘導率高(49．7%)。結(jié)論bFGF、BHA

2、能促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞。　　【關(guān)鍵詞】骨髓;間充質(zhì)干細胞;誘導分化;神經(jīng)元樣細胞　　　　【Abstract】ObjectiveToexplorethemeansoftransdifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSC)ofadultrattoneuronlikecellsinvitro.MethodsBMSCswhichwereisolatedfromadultratsusinggradientcentrifugationandsubculturedifferentiationwerei

3、nducedintoneuronlikecellsbycytokineandoxidane.Immunocytochemistryanalysisaexaminationwasperformed.aboutneuronspecificenolase(NSE)、neurofilamentprotein(NF)andglialfibrillaryacidicprotein7(GFAP)andflowingcytometryanalysisexaminationwasperfpomedinductivity.ResultsTheBMSCcouldbetransdifferentia

4、tedtoneuronlikecellswiththeexpressionofNestin.TheinduciblerateofBMSCwithbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)、butylatedhydroxyarisol(BHA)was49．8%.ConclusionbFGF、BHAcanfacilitatetheprocessofBMSCbeingdifferentiatedintoNeuralprecursorcells.　　【Keywords】Bonemarrow;Mesenchymalstemcells;Inductiondiff

5、erentiation;Neuronlikecells　　　　探討成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的體外分離、純化、擴增、傳代培養(yǎng)及定向誘導分化為神經(jīng)元樣細胞的更好方法,為BMSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床應用提供理論依據(jù)和技術(shù)方法。　　1材料與方法　　1．1材料和試劑成年Wistar大鼠,體質(zhì)量120g左右。Percoll分離液(美國Pharmacia公司),堿性成纖維細胞生長因子(bFGF,R&D公司),β2巰基乙醇(β2ME)、硫代甘油、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、二甲基亞砜(DMSO,Sig

6、ma公司),兔抗大鼠神經(jīng)元烯醇化酶(NSEMaxim公司)多克隆抗體、兔抗大鼠神經(jīng)絲蛋白(NF2Maxim公司)多克隆抗體和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAPMaxim公司)多克隆抗體及兔抗大鼠神經(jīng)巢蛋白(Nestin,Pharmingen公司)多克隆抗體。7　　1．2原代及傳代培養(yǎng)取成年的Wistar大鼠兩側(cè)股骨及脛骨,去兩端后將腔內(nèi)骨髓細胞沖出,利用Percoll分離液(1．073×103g/ml)進行梯度分離后,取含BMSCs的低密度層到MSCGM(骨髓間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基)中,在37℃,體積分數(shù)為5%CO2,95%濕度常規(guī)培養(yǎng)。細胞達90%融合后傳代。　　1．3定向誘

7、導MSCs分化　　取3～5代的BMSCs按0．4×106/ml接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細胞爬片,對照組采用方法a:1mmol/L硫代甘油的DMEM(10%FBS)預誘導24h,更換培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,再加入含5mmol/L硫代甘油的無血清DMEM誘導5h～6d。誘導出神經(jīng)元樣細胞最多時換用神經(jīng)細胞培養(yǎng)基。實驗組采用方法b預誘導試劑為10ng/mlbFGF,正式誘導試劑是200μmol/LBHA,其他條件不變。　　1．5鏡下對神經(jīng)前體細胞進行形態(tài)學觀察。　　1．6細胞免疫組化檢測