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《imp-4基因的克隆、原核表達及活性測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、IMP-4基因的克隆、原核表達及活性測定【摘要】目的:采用RT-PCR法獲取TIMP-4基因，并通過原核表達獲取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法:從SD大鼠心肌組織中提取總RNA，利用RT-PCR法擴增出TIMP-4基因，經(jīng)基因序列分析后構(gòu)建表達載體PET-28a(+)-TIMP-4，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)TIMP-4的表達。利用N2+-NTA純化和復(fù)性后，根據(jù)其骨肉瘤細胞遷移能力的影響檢測其活性。結(jié)果:克隆到編碼序列完全正確的大鼠TIMP-4基因，能在大腸桿菌中獲得高效表達，表達產(chǎn)物占全菌總蛋白的23.5%，N2+-NTA純化和
2、復(fù)性后，純度達90%以上。純化后的融合蛋白使骨肉瘤細胞株的遷移能力得到顯著抑制。結(jié)論:通過基因克隆和原核表達的方式可以大量獲得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白?！娟P(guān)鍵詞】TIMP-4基因克隆基因表達免疫活性Abstract:Objective:ToextractthegeneofTIMP-4withRT-PCRmethodsandobtainthebioactiveratTIMP-4fusionproteinexpressedinE.Coli.Methods:TotalRNAwasextractedfromcardiacmuscleofSDrat.
3、TIMP-4genewasobtainedandamplifiedwithRT-PCRmethod.Theisolatedfragmentwassequenced,recombinedwithplasmidpET-28a(+)atEcoRIandHindⅢsitesandtransformedintoE.colicells.Theexpressionof11TIMP-4wasinducedbyIPTG.TIMP-4proteinwaspurifiedandrenaturalizedbyN2+-NTA.Thecapabilityofinhibiting
4、migrationofosteosarcomacelllinewasusedasameasuretoassayitsviability.Results:TheTIMP-4geneoftherat,whichwasclonedandcorrectlycoded,couldbehighlyexpressedintheE.colistrain.TheexpressedproductoftheTIMP-4amountedfor23.5%ofthetotalbacterialprotein.TheTIMP-4amountedforatleast90%after
5、N2+-NTApurification.ThepurifiedTIMP-4proteincouldsignificantlyinhibitthemigrationofosteosarcomacellline.Conclusion:TIMP-4fusionproteinwithbioactivitycanbeobtainedprofuselybygenecloningandexpressioninE.Coli.Keywords:TIMP-4;geneclone;expression;viabilityassay目前對惡性腫瘤的治療尚缺乏非常有效的措施，
6、其主要原因在于腫瘤具有侵襲、轉(zhuǎn)移和基因變異等特性，對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制方面的研究成為腫瘤治療的關(guān)鍵。組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移得以實現(xiàn)的先決條件?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）為一類蛋白水解酶家族，它能降解多種膠原蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白等血管基膜和基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造合適的環(huán)境。金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue11inhibitorofmatrixmetalloproteinase，TIMP）的發(fā)現(xiàn)是腫瘤研究上的一大突破，它是MMP的天然抑制劑，目前根據(jù)發(fā)現(xiàn)的時間
7、順序分別稱為TIMP（1～4）。國內(nèi)外對于TIMP-4的功能已經(jīng)有了一些研究，但結(jié)果有所差異。Jiang等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-4可以抑制乳腺癌細胞的凋亡，而更多的實驗表明TIMP-4為腫瘤生長的抑制因素[2，3]。為進一步開展對TIMP-4在骨肉瘤和軟骨肉瘤方面的作用及其機制的研究，以及對其在其他領(lǐng)域的功能，本實驗采用分子生物學(xué)的基因克隆、表達和純化等手段，力求獲取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白，為以后的研究打下基礎(chǔ)。1資料和方法1.1材料1.1.1組織來源：成熟SD大鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。1.1.2菌種、質(zhì)粒和細胞：大腸桿菌
8、TG1、BL21(DE3)、pBluescriptSK(+)質(zhì)粒、表達質(zhì)粒pET-28a(+)均由第二軍醫(yī)大
