草魚nk-lysin基因的克隆、原核表達(dá)與活性分析

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1、第41卷第10期水產(chǎn)學(xué)報(bào)Vol.41,No.102017年10月JOURNALOFFISHERIESOFCHINAOct.,2017文章編號(hào):1000-0615(2017)10-1500-12DOI:10.11964/jfc.20160910553草魚NK-lysin基因的克隆、原核表達(dá)與活性分析王改玲*，王明成，李傳鳳，潘磊，劉盼婷(黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南駐馬店463000)摘要：為研究草魚抗菌肽NK-lysin基因的組成結(jié)構(gòu)、在組織中的表達(dá)差異及其抑菌活性，實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知魚類NK-lysin基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)上下游引物，采

2、用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆草魚NK-lysin基因(Cinkl)，RT-PCR進(jìn)行各組織間的表達(dá)分析，并構(gòu)建Cinkl成熟肽的原核表達(dá)載體，采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法檢測重組蛋白的抑菌活性。結(jié)果顯示，CinklcDNA全長768bp，編碼121個(gè)氨基酸；基因組DNA全長3361bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)多序列比對(duì)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，CiNkl氨基酸序列具有SAPLIP家族的特征：含有6個(gè)保守的半胱氨酸和saposinB蛋白結(jié)構(gòu)域，與斑馬魚Nklc、Nkld的相似性分別為57.98%和63.03%。構(gòu)建NK-lysi

3、n氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)CiNkl與斑馬魚Nklc、Nkld聚為一支。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，CinklmRNA在所有檢測的草魚組織中均有表達(dá)，在脾臟中表達(dá)量最高，心臟、鰓、中腎和頭腎的表達(dá)量次之，皮膚、腦、肝臟和腸有微量表達(dá)。pET-28b-MBP與CiNkl成熟肽序列構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒在宿主菌Rosetta(DE3)表達(dá)出約57ku的可溶性融合蛋白，利用Ni-NTAHis·Bind樹脂進(jìn)行純化，CiNkl重組蛋白對(duì)G–細(xì)菌如大腸桿菌M15株、嗜水氣單胞菌，以及G+細(xì)菌如金黃色葡萄球菌均具有抑菌活性。基于草魚NK-lysin的

4、組織表達(dá)特征和重組蛋白的抑菌活性，推測NK-lysin在草魚的先天性免疫防御中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞:草魚；NK-lysin；基因克?。唤M織表達(dá)；抑菌活性中圖分類號(hào):Q786；S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)是一類水產(chǎn)動(dòng)物(魚類、蝦和蟹)的免疫力和抗病力[3-5]。對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、原蟲和腫瘤細(xì)NK-lysin是機(jī)體自然殺傷(naturalkiller,NK)胞等具有殺傷作用的小分子多肽(12~50個(gè)氨基細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes,酸

5、)，是生物體先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成CTLs)中存在的一種被稱為“顆粒溶素”(granulysin)部分?？咕木哂锌咕V廣、生化性質(zhì)穩(wěn)定、的抗菌肽，與人顆粒溶素屬于直系同源基因。毒副作用低、不易產(chǎn)生耐藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)，一NK-lysin是鞘脂激活蛋白樣蛋白(saposin-like直被人們認(rèn)為是抗生素的理想替代品[1]。迄今為protein,SAPLIP)家族的成員，具有鞘脂激活蛋白止，人們在細(xì)菌、真菌、植物、無脊椎動(dòng)物以B(saposinB)結(jié)構(gòu)域和6個(gè)保守的半胱氨酸，且富及脊椎動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類超過2000種，含帶正電荷

6、的氨基酸[6]。NK-lysin具有與膜結(jié)合其中已被鑒定的水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽種類包括的能力，并能夠改變細(xì)胞膜的完整性，能夠殺hepcidin、defensin、pleurocidin、piscidin、滅細(xì)菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞等[7-9]。moronecidin、misgurain、parasin、LEAP-2和自最早的人類granulysin[10]和豬NK-lysin[11]發(fā)NK-lysin等[2]?？咕脑谒a(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究現(xiàn)以來，人們相繼在牛(Bostaurus)[12]、馬(Equus已取得一定成效，通過在飼料中添加抗

7、菌肽，可提高caballus)[13]、水牛(Bubalusbubalis)[14]、雞(Gallus收稿日期：2016-09-23修回日期：2016-11-30資助項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31402334)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(142300410111)通信作者：王改玲，E-mail：wgl939@126.comhttp://www.scxuebao.cn10期王改玲，等：草魚NK-lysin基因的克隆、原核表達(dá)與活性分析1501gallus)[15]、斑點(diǎn)叉尾鲖(Ictaluruspunctatus)[16-17]、1/

8、3。馴養(yǎng)結(jié)束后，挑選平均體質(zhì)量約為115g的牙鲆(Paralichthysolivaceus)[18]、半滑舌鰨(Cynog-草魚3尾，用于提取草魚各組織總RNA。lossussemilaevis)[8]、斑馬魚(Dan