小鼠幾丁質(zhì)酶的重組表達(dá)和抗體制備

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1、小鼠幾丁質(zhì)酶的重組表達(dá)和抗體制備【摘要】目的:檢測脂多糖（LPS）刺激成骨細(xì)胞后,幾丁質(zhì)酶（chitotriosidase）基因表達(dá)變化情況。進(jìn)行小鼠chitotriosidase的原核和真核表達(dá),并利用原核表達(dá)純化的蛋白,制備兔抗鼠多克隆抗體。方法:用LPS刺激MC3T3E1細(xì)胞,提取mRNA,通過RTPCR獲得小鼠chitotriosidase的編碼區(qū)全長序列,克隆進(jìn)pRSETA載體,轉(zhuǎn)化BL21菌株,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。獲得的包涵體蛋白用鎳柱純化后,作為抗原免疫兔子,制備多克隆抗體。用該抗體檢測真核表達(dá)的小鼠chitotr

2、iosidase蛋白,并確定抗體的靈敏度和特異性。結(jié)果:LPS明顯刺激chitotriosidase表達(dá)。原核表達(dá)的包涵體蛋白經(jīng)鎳柱純化后也能制備出效果較好的多克隆抗體。結(jié)論:成功地克隆表達(dá)了小鼠的chitotriosidase蛋白,并制備出高靈敏度、高特異性的多克隆抗體,為進(jìn)一步闡明chitotriosidase在病理條件下的表達(dá)變化和功能提供了一條途徑?！娟P(guān)鍵詞】幾丁質(zhì)酶;脂多糖;重組表達(dá);多克隆抗體幾丁質(zhì)酶（chitotriosidase）是一類特異性水解幾丁質(zhì)的蛋白。雖然在哺乳動物體內(nèi)還沒有發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì),研究人員已經(jīng)在人、大

3、鼠等物種中克隆得到了chitotriosidase及幾個相關(guān)家族成員,它們都屬于糖水解酶18家族。大量文獻(xiàn)報導(dǎo),9chitotriosidase在很多與炎癥反應(yīng)相關(guān)的疾病患者體內(nèi)表達(dá)升高。在體外試驗中也已證明,IFNγ和TNFα等炎癥性細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)chitotriosidase表達(dá)［1,2］。但是,該基因的功能目前尚不清楚。我們用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激成骨細(xì)胞株MC3T3E1,發(fā)現(xiàn)chitotriosidase表達(dá)升高。我們從LPS刺激的細(xì)胞中提取RNA,通過RTPCR得到該基因的全

4、長編碼序列,并進(jìn)行了該蛋白的原核和真核表達(dá)。以原核表達(dá)純化的蛋白為抗原,制備抗體,為今后研究該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料大腸桿菌BL21為本實驗室保存,質(zhì)粒pRSETA和pcDNA3.1D為Invitrogen公司產(chǎn)品。新西蘭大白兔(雄性,質(zhì)量250kg)購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心;各種限制性內(nèi)切酶、dNTP、TaqDNA聚合酶和Pfu聚合酶購自TaKaRa公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000,TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司;鎳柱,LPS,完全弗氏佐劑和

5、不完全弗氏佐劑購自Sigma公司;DMEM為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清購自杭州四季青公司;抗Histag抗體購自Merck公司;HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒為KPL公司產(chǎn)品。蛋白定量試劑盒購自Biorad公司。引物合成和測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。小鼠來源的成骨細(xì)胞株MC3T3E1購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心,cos7細(xì)胞為本試驗室保存。91.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和LPS刺激細(xì)胞方法MC3T3E1細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM（含100mL/LFBS）,置于37℃、50mL/LCO2溫箱中。待細(xì)胞

6、達(dá)到90%匯合時,接種6孔板。過夜后,加入LPS至終濃度為10mg/L。檢測chitotriosidase的表達(dá)變化的引物序列:上游引物:5′GACCCTGTTAGCCGTTGG3′,下游引物:5′CTTGGAGTCTCGGATGGA3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證明序列正確。1.2.2小鼠chitotriosidase編碼區(qū)全長序列的獲得和真核與原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建LPS刺激細(xì)胞6h后,棄去培養(yǎng)液,直接加入1mLTRIzol。然后按照說明書提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用PCR的方法獲得chitotriosidase編碼區(qū)的全

7、長序列（不含信號肽）,在引物的末端分別加入XhoⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。引物序列為:上游引物5′GATCTCGAGGCAAAACTGGTCTGCTACCTC3′,下游引物5′CTAGAATTCGCTCCAGGTACAACATTTGC3′;克隆到pRSETA載體,命名為chpRSET。另外設(shè)計一對引物,在末端分別加入XbaⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)。引物序列為:上游引物5′ATGCGGCCGCATGGTGCAGTCCCTGGCCT3′,下游引物5′CTATCTAGAGCTCCAGGTACAACATTTGC3′,克隆

8、到pcDNA3.1D載體,命名為chpcDNA。以上兩個載體經(jīng)測序證明序列正確。91.2.3融合蛋白的表達(dá)、純化和定量把表達(dá)載體chpRSET轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,經(jīng)1mmol/LIPTG誘導(dǎo)5h,超聲波裂解細(xì)胞,離心收集包涵體。用8mol