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《小鼠附睪特異性輔脂酶的原核表達(dá)及其抗體的制備.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、第31卷第2期暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)VO1．31No．22010年4月JounlalofJinanUniversity(MedicineEdition)Apr．2010小鼠附睪特異性輔脂酶的原核表達(dá)及其抗體的制備關(guān)藝青，禹艷紅，黃丹，潘善培(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生殖免疫研究所，廣東廣州510632)[摘要]目的：利用原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)小鼠附睪特異性輔脂酶(meClps)，并制備抗meClps抗體。方法：通過生物信息分析meClps蛋白結(jié)構(gòu)，Oligo6設(shè)計(jì)引物，PCR法從小鼠附睪eDNA中擴(kuò)增胱C全長(zhǎng)序列并克隆到pMD19一T載體中。將含腳c序列pMD19一T載體通過PC
2、R擴(kuò)增成熟肽區(qū)段序列，重組到pET-21b原核表達(dá)載體上，經(jīng)菌落PCR及測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株EcoliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后用Trieine．SDS．PAGE和Westernblotting檢測(cè)重組meClps的表達(dá)。包涵體沉淀經(jīng)濃度為2mol／L尿素洗滌，Trieine．SDS．PAGE分離、染色、脫色，切下目的條帶用生理鹽水浸泡、磨碎與弗氏佐劑混合后免疫新西蘭大白兔獲取免疫血清，Westernblotting檢測(cè)抗體與meClps反應(yīng)。結(jié)果：在原核表達(dá)系統(tǒng)成功重組表達(dá)meClps，目的蛋白主要以包涵體形式存在，制備了高效價(jià)的兔抗meClps抗體。
3、結(jié)論：成功建立meClps的原核表達(dá)系統(tǒng)和獲得兔抗meClps抗體。[關(guān)鍵詞]附睪；輔脂酶；原核表達(dá)；抗體[中圖分類號(hào)】R715．2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A[文章編號(hào)】1000—9965(2010)02—0105—06Prokaryoticexpressionofmouseepididymis-specificcolipaseandpreparationofitsantibodyGUANYi—qing，YUYan—hong，HUANGDan，PANShan—pei(InstituteofReproductiveImmunology，ColegeofLifeScienceandTechn
4、ology，JinanUniversity，Guangzhou510632，P．R．China)[Abstract]Ainl：Toexpressmouseepididymis—specificcolipase(meClps)inpmkaryoticsystemandpreparetheanti—meClpsantibody．Methods：ThemeClpsproteinstructurewasanalysedbyusingbioin—formation，andprimersweredesignedwithOligo6．Thefull—lengthofmeClpswasampl
5、ifiedfrommouseepididymalcDNAandclonedintopMD]9一Tvector．ThesequenceofmaturepeptidewasobtainedbyPCRfrompMD19一TvectorwithmeClps．Thentheproductwasrecombinedintothepmkaryoticexpressionvec—torpET-21b．TherecombinantplasmidwasidentifiedbyclonePCRandsequencingbefore~ansformationintocoliBL21(DE3)．Afte
6、rinducedbyIPTG，therecombinantmeClpsproteinwasexpressedandsepreatedbyTrieine—SDS—PAGE，andthenidentifiedbyWesternblotting．Theinclusionbodieswerewashedwith2mol／LureaandsepreatedbyTricine—SDS—PAGE．Afterstaininganddestaining，thegelcontainingmeClpsproteinwascut，equilibratedwithphysiologicalsalines
7、olution，rubbed，andemulsi—fledwithFreundadjuvant，thenusedasantigentoimmunizerabbitandprepareantibodies．Theanti-meClpsantibodyresponsewasidentifiedbyWesternblotting．Results：ThemeClpsproteinwassuccess-fullyexpressedinprokaryoticsystem．butmainlyininclu
