重組人干擾素α2b軟膏(假單胞菌) (新增)

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1、重組人干擾素α2b軟膏(假單胞菌)ChongzuRenGanraosuα2bRuangao(Jiadanbaojun)RecombinantHumanInterferonα2bOrintments(P.putida)本品系由高效表達人干擾素a2b基因的腐生型假單胞菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化后，加入軟膏基質(zhì)制成。1.基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。2.制造2.1工程菌菌種2.1.1名稱及來源重組人干擾素a2b工程菌株系由帶有人干擾素a2b基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的腐生型假單胞菌菌株(PseudomonasputidaVG-4)。2.1.2種子批

2、的建立應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的規(guī)定。2.1.3菌種檢定主種子批和工作種子批的菌種應(yīng)進行以下各項全面檢定。2.1.3.1劃種LB瓊脂平板應(yīng)呈典型的腐生型假單胞菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長。2.1.3.2染色鏡檢應(yīng)呈棒狀，可運動，有莢膜，無芽孢。涂片染色應(yīng)呈典型的革蘭陰性。2.1.3.3對抗生素的抗性應(yīng)與原始菌種相符。2.1.3.4電鏡檢查（工作種子批可免作）應(yīng)為典型的腐生型假單胞菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。2.1.3.5生化反應(yīng)不液化明膠、不水解淀粉和聚β-羥基丁酸酯（附錄ⅪⅤ），不能利用反硝化作用進行厭氧呼吸，能夠合成熒光色素。應(yīng)符合腐生型假單胞菌

3、生物學(xué)性狀。2.1.3.6干擾素表達量在搖床中培養(yǎng)，應(yīng)不低于原始菌種的表達量。2.1.3.7表達的干擾素型別應(yīng)用抗a2b型干擾素參考血清做中和試驗，證明型別無誤。2.1.3.8質(zhì)粒檢查該質(zhì)粒的酶切圖譜應(yīng)與原始重組質(zhì)粒相符。2.1.3.9目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）目的基因核苷酸序列應(yīng)與批準序列相符。2.2原液2.2.1種子液制備將檢定合格的工作種子批菌種接種于適宜的培養(yǎng)基（可含適量抗生素）中培養(yǎng)，供發(fā)酵罐接種用。2.2.2發(fā)酵用培養(yǎng)基采用適宜的不含任何抗生素的培養(yǎng)基。2.2.3種子液接種及發(fā)酵培養(yǎng)在滅菌培養(yǎng)基中接種適量種子液。在適宜的溫度下進行發(fā)酵，應(yīng)采用經(jīng)批準的發(fā)酵工

4、藝，并確定相應(yīng)的發(fā)酵條件，如溫度、pH值、溶氧、補料、發(fā)酵時間等。發(fā)酵液應(yīng)定期進行質(zhì)粒丟失率檢查（附錄ⅨG）。2.2.4發(fā)酵液處理用高速離心法收集處理菌體。收集到的菌體可在-20℃以下保存，應(yīng)不超過1年。2.2.5初步純化采用經(jīng)批準的純化工藝進行初步純化，使其純度達到規(guī)定的要求。2.2.6高度純化經(jīng)初步純化后，采用經(jīng)批準的工藝進行高度純化，使其達到3.1項要求，即為干擾素原液。除菌過濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.7原液檢定按3.1項進行。2.3軟膏劑制備采用的基質(zhì)應(yīng)符合軟膏劑基質(zhì)要求（附錄IG）。2.3.1配制按經(jīng)批準的配方進行配制。2.3.2軟膏制備按經(jīng)批準的工藝進行

5、。軟膏質(zhì)地應(yīng)均勻、細膩、涂展性良好，排除氣泡。2.4成品2.4.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2規(guī)格應(yīng)為經(jīng)批準的規(guī)格。2.4.3包裝應(yīng)符合”生物制品包裝規(guī)程”和附錄ⅠG的規(guī)定。3.檢定3.1原液檢定3.1.1生物學(xué)活性依法測定（附錄XC）。3.1.2蛋白質(zhì)含量依法測定（附錄VIB第二法）。3.1.3比活性為生物學(xué)活性與蛋白質(zhì)含量之比，每1mg蛋白質(zhì)應(yīng)不低于1.0×108IU。3.1.4純度3.1.4.1電泳法依法測定（附錄IVC）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15%，加樣量應(yīng)不低于10μg(考馬斯亮藍R250染色法)或5μg(銀染法)。經(jīng)掃描

6、儀掃描，純度應(yīng)不低于95.0％。3.1.4.2高效液相色譜法依法測定（附錄IIIB）。色譜柱以適合分離分子質(zhì)量為5～60kD蛋白質(zhì)的色譜用凝膠為填充劑；流動相為0.1mol/L磷酸鹽-0.1mol/L氯化鈉緩沖液，pH7.0；上樣量應(yīng)不低于20mg，于波長280nm處檢測，以干擾素色譜峰計算理論塔板數(shù)，應(yīng)不低于1000。按面積歸一化法計算，干擾素主峰面積應(yīng)不低于總面積的95.0%。3.1.5分子量依法測定（附錄IVC）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度為15%，加樣量應(yīng)不低于1.0μg，分子質(zhì)量應(yīng)為19.2kD±1.92kD。3.1.6外源性DNA殘留量每1支應(yīng)不高

7、于10ng每1μg蛋白質(zhì)應(yīng)不高于2ng（附錄IXB）。3.1.7宿主菌蛋白殘留量應(yīng)不高于總蛋白質(zhì)的0.02%（附錄IXD）。3.1.8殘余抗生素活性依法測定（附錄IXA），不應(yīng)有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。3.1.9等電點主區(qū)帶應(yīng)為5.7—6.7,供試品的等電點與對照品的等電點圖譜一致（附錄IVD）。3.1.10紫外光譜掃描用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至約100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波長230nm～360nm下進行掃描，最大吸收