測定α-淀粉酶活力的方法

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1、實驗五激活劑、抑制劑、溫度及PH對酶活性的影響一、目的要求通過實驗加深對酶性質(zhì)的認識，了解測定α-淀粉酶活力的方法。二、實驗原理酶是生物體內(nèi)具有催化作用的蛋白質(zhì)，通常稱為生物催化劑。酶催化的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。生物催化劑催化生化反應(yīng)時具有：催化效率好、有高度的專一性、反應(yīng)條件溫和、催化活力與輔基，輔酶，金屬離子有關(guān)等特點。能提高酶活力的物質(zhì)，稱為激活劑。激活劑對酶的作用有一定的選擇性，其種類多為無機離子和簡單的有機化合物。使酶的活力中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的催化作用受抑制或喪失的物質(zhì)稱為酶抑制劑。氯離子為唾液

2、淀粉酶的激活劑，銅離子為其抑制劑。應(yīng)注意的是激活劑和抑制劑不是絕對的，有些物質(zhì)在低濃度時為某種酶的激活劑，而在高濃度時則為該酶的抑制劑。如氯化鈉達到約30%濃度時可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反應(yīng)中，反應(yīng)速度達到最大值時的溫度和PH值稱為某種酶作用時的最適溫度和PH值。溫度對酶反應(yīng)的影響是雙重的：一方面隨著溫度的增加，反應(yīng)速度也增加，直至最大反應(yīng)速度為止；另一方面隨著溫度的不斷升高，而使酶逐步變性從而使反應(yīng)速度降低。同樣，反應(yīng)中某一PH范圍內(nèi)酶活力可達最高，在最適PH的兩側(cè)活性驟然下降，其變化趨勢呈鐘形曲線變化。食

3、品級α-淀粉酶是一種由微生物發(fā)酵生產(chǎn)而制備的微生物酶制劑，主要由枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉等微生物產(chǎn)生。但不同菌株產(chǎn)生的酶在耐熱性、酶促反應(yīng)的最適溫度、PH、對淀粉的水解程度，以及產(chǎn)物的性質(zhì)等均有差異。α-淀粉酶屬水解酶，作為生物催化劑可隨機作用于直鏈淀粉分子內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，迅速地將直鏈淀粉分子切割為短鏈的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉與碘的反應(yīng)逐漸消失，這種作用稱為液化作用，生產(chǎn)上又稱α-淀粉酶為液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支鏈的α-1,6糖苷鍵，因此最終水解產(chǎn)物是麥芽糖、葡萄糖和α-1

4、,6鍵的寡糖。本實驗通過淀粉遇碘顯藍色，糊精按其分子量的大小遇碘顯紫藍、紫紅、紅棕色，較小的糊精（少于6個葡萄糖單位）遇碘不顯色的呈色反應(yīng)，來追蹤α-淀粉酶作用于淀粉基質(zhì)的水解過程，從而了解酶的性質(zhì)以及動力學(xué)參數(shù)。三、激活劑和抑制劑對唾液淀粉酶活力的影響（一）試劑及材料1、1：30唾液淀粉酶配置用蒸餾水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸餾水稀釋。2、0.2%可溶性淀粉稱取可溶性淀粉0.2g，預(yù)加20mL蒸餾水調(diào)勻，然后倒入80mL沸水中，繼續(xù)煮沸至溶液透明，冷卻后補水至100mL。3、1%NaCl溶液稱取1

5、.0g氯化鈉，加水溶解稀釋至100mL。4、1%CuSO4溶液稱取1.0g硫酸銅，加水溶解稀釋至100mL。5、標準稀碘液稱取11g碘，22g碘化鉀，置研缽中，加入適量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀釋定容至500mL。吸取2mL上述碘液，加入10g碘化鉀，用水稀釋至500mL。（二）儀器設(shè)備電熱恒溫水浴鍋。（三）操作方法取試管3根，編號后按下表配置實驗樣液。試管序號0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuSO4蒸餾水混勻，放入37℃水浴中保溫10min。立即加入唾液淀粉酶。1：30唾液淀粉酶12.0mL1.0mL/

6、/1.0mL22.0mL/1.0mL/1.0mL32.0mL//1.0mL1.0mL用點滴管并不斷從試管中吸取樣液于比色白瓷板，用稀碘液檢驗試管內(nèi)淀粉被淀粉酶水解的程度，記錄各試管內(nèi)樣液遇碘不顯藍色的先后順序，解釋實驗現(xiàn)象的原因。四、溫度與PH值對α-液化淀粉酶活力的影響（一）試劑與材料1、2%可溶性淀粉溶液稱取可溶性淀粉2.0g（預(yù)先在105℃烘干），預(yù)加20mL蒸餾水調(diào)勻，然后傾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷卻后定容至100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液（1

7、）0.2mol/mLNa2HPO4稱取35.60gNa2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。（2）使用酸度計，用檸檬酸調(diào)整至所需的PH值。3、供試酶液的制備稱取固體α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖溶液100mL(緩沖液的加入量視酶活力大小而定，控制酶解反應(yīng)在5-10min內(nèi)完成)，于40℃恒溫水浴中活化0.5小時，然后用3000rpm/min離心機離心分離5min，酶提取液于冰箱保存，供試驗用。4、標準比色液甲液：稱取氯化鈷（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重鉻酸

8、鉀0.4748g，溶解并定容至500mL。乙液：稱取鉻黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。使用時取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合?；旌媳壬阂朔胖帽浔４?，使用7天后重新配置。5、標準稀碘液。（二）儀器設(shè)備電熱恒溫水浴鍋。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量標準比色液于白色瓷比色板空穴中，作為判斷酶解反應(yīng)終點的標準色。2、不同溫度對α-液化淀粉酶活力的影響取