淀粉酶活力的測(cè)定方法

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1、淀粉酶活力的測(cè)定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶隨機(jī)作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分α-1,4糖苷鍵，單獨(dú)使用時(shí)最終生成寡聚葡萄糖、α-極限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6以下可使其鈍化。β-淀粉酶從非還原端作用于α-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的α-1,6鍵時(shí)停止。單獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)物為麥芽糖和β-極限糊

2、精。β-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl—等輔助因子，最適pH偏酸，與α-淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，60℃保溫15min可使其鈍化。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同時(shí)存在?？梢韵葴y(cè)定（α+β）淀粉酶總活力，然后在60℃加熱15min，鈍化β-淀粉酶，測(cè)出α-淀粉酶活力，用總活力減去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應(yīng)來測(cè)定。還原糖作用于黃色的3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，生成物顏色的

3、深淺與還原糖的量成正比。以每克樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。1酶活測(cè)定方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(見下表)①取7支20ml具塞刻度試管,預(yù)先潔凈滅菌干燥,編號(hào),按表加入試劑。②搖勻,至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻,加蒸餾水定容至20ml,以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn),在520nm的波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值。并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液成分表及OD測(cè)定值試劑1234567麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.

4、81.41.00.60.203,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麥芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力測(cè)定①待測(cè)粗酶液的制備：發(fā)酵24h后發(fā)酵液4000r/min離心10min,去除菌體，在上清液中加入65％飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4℃鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。②按以下順序操作：取預(yù)先潔凈滅菌干燥試管,編號(hào)。取粗酶液1ml于各只試管中，于60℃水浴中預(yù)熱5min檸檬

5、酸淀粉緩沖液同時(shí)在60℃水中預(yù)熱5min，→取檸檬酸淀粉緩沖液1ml加入試管中,于60℃水浴中保溫30min→加入1.5ml3,5-二硝基水楊酸,沸水中5min,加入氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),加蒸餾水至20ml?！鷵u勻,用分光光度計(jì)測(cè)定OD520nm值。在上述條件下以單位體積樣品在30min釋放1mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)麥芽糖單位表示酶活性。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量按下列公式計(jì)算酶活力酶活力測(cè)定公式：淀粉酶活力=麥芽糖含量（mg）·淀粉酶原液總體積（mL）/所加淀粉質(zhì)量每個(gè)樣品按下表所示步驟操作，

6、在反應(yīng)過程中，從加入底物開始，向每支管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致：表2樣品酶活力測(cè)定步驟反應(yīng)順序樣品（重復(fù)3個(gè)）樣品空白標(biāo)準(zhǔn)空白樣品稀釋液（ml）110蒸餾水00160℃預(yù)熱5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60℃保溫30min依次加入DNS試劑（ml）1.51.51.5混合100℃煮沸5min加入0.4mol/LNaOH溶液終止反應(yīng)加入蒸餾水至總體積（ml）202020反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4,000rpm離心10min，上清液以標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)

7、零，在分光光度計(jì)520nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品空白（A0）和樣品溶液（A）的吸光值，A－A0為實(shí)測(cè)吸光值。用直線回歸方程計(jì)算樣品淀粉酶的活性。2活性計(jì)算酶活力單位定義：在60℃、PH5.6條件下，每小時(shí)從2％的可溶性淀粉溶液中釋放出1mg爾麥芽糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）淀粉酶活性U按下式計(jì)算：K×（A－A0）S×（30÷60）×180U=×F其中：U——樣品淀粉酶活性，U/ml；K——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；F——樣品溶液反應(yīng)前的總量，ml；S——樣品測(cè)試量；表1中S＝1ml；60——1小時(shí)為60min；30—

8、—反應(yīng)時(shí)間，min。試劑(1)2%淀粉溶液(2)0.4mol/L氫氧化鈉(3)pH5.6檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，為A液。稱取檸檬酸鈉29.41g，溶解后定容至1000mL，為B液。取A液13.7mL與B液26.3mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。(4)3,5-二硝基水楊酸精確稱取1g3,5-二硝基水楊酸溶于20mL1mol/L氫氧化鈉中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至