dns法測(cè)定α-淀粉酶活力的方法

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1、利用DNS法測(cè)定α-淀粉酶活力的方法目的要求了解生物學(xué)研究中針對(duì)糖含量測(cè)定的常用方法及相關(guān)原理。掌握一般標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的意義及要求。掌握DNS比色法測(cè)定α-淀粉酶活力的原理、方法及操作步驟。掌握利用EXCEL分析工具庫(kù)數(shù)據(jù)分析——回歸分析，得到回歸方程及相關(guān)分析結(jié)果。糖的測(cè)定方法大致可分為三類：1.物理法——旋光法、折光法、比重法；2.物理化學(xué)法——點(diǎn)位法、極普法、光度法、色譜法；3.化學(xué)方法——斐林氏法、高錳酸鉀法、碘量法、鐵氰化鉀法、DNS比色法、蒽酮比色法、咔唑比色法生物學(xué)研究中關(guān)于糖測(cè)定中常用的方法菲林試劑滴定—

2、—還原糖，常量分析DNS比色法——還原糖，微量分析蒽酮比色法——總糖，微量分析配制系列濃度稀釋液的方法線性稀釋——稀釋液的濃度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；對(duì)數(shù)稀釋（倍數(shù)稀釋）——系列溶液的濃度比是一常數(shù)，取決于稀釋梯度——2倍稀釋（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀釋（1、1/10、1/100、1/1000……）；調(diào)和濃度稀釋——系列溶液的濃度為連續(xù)排列整數(shù)的倒數(shù)（1，1/2，1/3，1/4，1/5……）。α-淀粉酶酶活力測(cè)定的原理底物（反應(yīng)物）為淀粉——碘比色法（反應(yīng)一定量

3、淀粉為糊精的時(shí)間）產(chǎn)物為麥芽糖、糊精等——麥芽糖為還原糖，可以用測(cè)定還原糖的方法來(lái)測(cè)定其生成量（如DNS法），從而計(jì)算出酶活力單位。DNS試劑測(cè)定還原糖的原理淀粉酶催化產(chǎn)生的還原糖（麥芽糖等）能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，其反應(yīng)如下：淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)濃度的麥芽糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測(cè)定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位樣品（重量或體積）在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。酶活力測(cè)定（DNS比色法）酶活力定義：在一定反應(yīng)條件下（本實(shí)驗(yàn)

4、為40℃，pH5.6或6.0），1分鐘反應(yīng)生成1mg麥芽糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。注意：去除β-淀粉酶的干擾（β-淀粉酶不熱耐，在70℃15min鈍化）——植物材料來(lái)源需要注意。本此實(shí)驗(yàn)中忽略不計(jì)。檢測(cè)的原理：酶解的產(chǎn)物之一——麥芽糖具有還原性，可以使試劑中的3，5-二硝基水楊酸還原，形成紅色的物質(zhì)，在540nm下有吸收峰，并和濃度呈一定線性關(guān)系。計(jì)算公式：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑配制說(shuō)明21g氫氧化鈉（先加入溶解）；182g酒石酸鉀鈉（同上）；6.3gDNS（3，5-二硝基水楊酸），

5、加熱完全溶于上述溶液中；5g重蒸苯酚（冷卻后加入）；5g無(wú)水亞硫酸鈉（冷卻后加入）；完全溶解后定容至1000ml，貯存時(shí)間越長(zhǎng)越穩(wěn)定。引自：朱儉，曹凱鳴，周潤(rùn)琦，蔡武城，袁厚積編著．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1981．標(biāo)準(zhǔn)曲線法取標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波長(zhǎng)處（通常為λmax），用同樣厚度的吸收池分別測(cè)定其吸光度，以吸光度（OD）為縱坐標(biāo)，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)的直線－標(biāo)準(zhǔn)曲線（工作曲線）。理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足以下條件：1、至少5個(gè)點(diǎn)，一般不超過(guò)7個(gè)點(diǎn)；2、2個(gè)以

6、上重復(fù)值；3、重復(fù)值誤差小于5%；4、點(diǎn)與線的垂直距總和最??；注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線不能任意延長(zhǎng)?。ㄓ幸欢y(cè)定范圍）理想標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點(diǎn)過(guò)原點(diǎn)的直線；斜率為1（45°）；濃度為待測(cè)物質(zhì)濃度的一半～二倍；OD值在0.05～0.8之間（最好控制在0.2～0.6）。mg/ml麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支干凈的具塞刻度25mL比色管，編號(hào)，按下表中加入相關(guān)試劑；混勻后，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至25mL。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度。以麥芽糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（OD）為縱坐

7、標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?！兴r(shí)不要加塞！利用Excel中相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析工具，完成回歸方程的計(jì)算及分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相關(guān)試劑（第一種）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/mL）：精確稱取1g麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸（C6H8O7·H2O）5.78g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）21.32g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。1%馬鈴薯淀粉溶液：稱取1g馬鈴薯淀粉（105℃烘干2hr）溶于100mL0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中（一般需要

8、密封121.3℃滅菌處理20min）。相關(guān)試劑（第二種）標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/mL）：精確稱取1g麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。0.2mol/LpH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）45.3g，檸檬酸（C6H8O7·H2O）7.74g，先在燒杯中用蒸餾水使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量