淀粉酶活力的測定方法

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1、淀粉酶活力的測定方法淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動物、植物和微生物界。不同來源的淀粉酶，性質有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶隨機作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分α-1,4糖苷鍵，單獨使用時最終生成寡聚葡萄糖、α-極限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使α-淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6以下可使其鈍化。β-淀粉酶從非還原端作用于α-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的α-1,6鍵時停止。單獨作用時產物為麥芽糖和β-極限糊精。β

2、-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl—等輔助因子，最適pH偏酸，與α-淀粉酶相反，它不耐熱但覺耐酸，60℃保溫15min可使其鈍化。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同時存在?？梢韵葴y定（α+β）淀粉酶總活力，然后在60℃加熱15min，鈍化β-淀粉酶，測出α-淀粉酶活力，用總活力減去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應來測定。還原糖作用于黃色的3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，生成物顏色的深淺與還原糖

3、的量成正比。以每克樣品在一定時間內生成的還原糖（麥芽糖）量表示酶活大小。1酶活測定方法（1）標準曲線的制作(見下表)①取7支20ml具塞刻度試管,預先潔凈滅菌干燥,編號,按表加入試劑。②搖勻,至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻,加蒸餾水定容至20ml,以1號管作為空白調零點,在520nm的波長下比色測定吸光度值。并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1標準麥芽糖溶液成分表及OD測定值試劑1234567麥芽糖標準液（mL）00.20.61.01.41.82.0H2O（mL）2.01.81.41.00.

4、60.203,5-二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0麥芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.0OD520(2)粗酶液淀粉酶活力測定①待測粗酶液的制備：發(fā)酵24h后發(fā)酵液4000r/min離心10min,去除菌體，在上清液中加入65％飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4℃鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。②按以下順序操作：取預先潔凈滅菌干燥試管,編號。取粗酶液1ml于各只試管中，于60℃水浴中預熱5min檸檬酸淀粉緩沖液同時在60℃

5、水中預熱5min，→取檸檬酸淀粉緩沖液1ml加入試管中,于60℃水浴中保溫30min→加入1.5ml3,5-二硝基水楊酸,沸水中5min,加入氫氧化鈉溶液終止反應,加蒸餾水至20ml?！鷵u勻,用分光光度計測定OD520nm值。在上述條件下以單位體積樣品在30min釋放1mg麥芽糖所需的酶量為一個麥芽糖單位表示酶活性。在標準曲線上查出相應的麥芽糖含量按下列公式計算酶活力酶活力測定公式：淀粉酶活力=麥芽糖含量（mg）·淀粉酶原液總體積（mL）/所加淀粉質量每個樣品按下表所示步驟操作，在反應過程中，從加入底物開始，

6、向每支管中加入試劑的時間間隔要絕對一致：表2樣品酶活力測定步驟反應順序樣品（重復3個）樣品空白標準空白樣品稀釋液（ml）110蒸餾水00160℃預熱5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.51.5混合60℃保溫30min依次加入DNS試劑（ml）1.51.51.5混合100℃煮沸5min加入0.4mol/LNaOH溶液終止反應加入蒸餾水至總體積（ml）202020反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現混濁需在離心機上以4,000rpm離心10min，上清液以標準空白調零，在分光光度計520nm波長處測定

7、樣品空白（A0）和樣品溶液（A）的吸光值，A－A0為實測吸光值。用直線回歸方程計算樣品淀粉酶的活性。2活性計算酶活力單位定義：在60℃、PH5.6條件下，每小時從2％的可溶性淀粉溶液中釋放出1mg爾麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）淀粉酶活性U按下式計算：K×（A－A0）S×（30÷60）×180U=×F其中：U——樣品淀粉酶活性，U/ml；K——標準曲線斜率；F——樣品溶液反應前的總量，ml；S——樣品測試量；表1中S＝1ml；60——1小時為60min；30——反應時間，min。試劑(1)2%淀粉溶液

8、(2)0.4mol/L氫氧化鈉(3)pH5.6檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，為A液。稱取檸檬酸鈉29.41g，溶解后定容至1000mL，為B液。取A液13.7mL與B液26.3mL混勻，即為pH5.6之緩沖液。(4)3,5-二硝基水楊酸精確稱取1g3,5-二硝基水楊酸溶于20mL1mol/L氫氧化鈉中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至