淀粉酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方案

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1、綜合實(shí)驗(yàn)一α-淀粉酶的搖瓶發(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握微生物發(fā)酵的基本流程；2、通過(guò)淀粉的發(fā)酵制過(guò)程掌握菌種制備、發(fā)酵過(guò)程控制、中間參數(shù)測(cè)定等基本生物工程技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、枯草芽胞桿菌2、DNS法測(cè)還原糖3、α-淀粉酶活性測(cè)定4、α-淀粉酶效價(jià)測(cè)定三、儀器與材料1、發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖（1.5%），玉米淀粉(0.2%)，酵母膏(0.02%)，蛋白胨(3%)，氯化銨(0.01%)，硫酸鎂(0.05%)，磷酸二氫鈉(0.15%)，磷酸氫二鈉(0.3%)；2、菌種：枯草芽胞桿菌；3、試劑：1mol/LNaOH，1mol/LHCl

2、、pH6.0的磷酸緩沖液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）、DNS溶液（棕色瓶?jī)?chǔ)藏）、稀碘液、LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L）等；4、其它：天平，藥匙，廣泛pH試紙，玻璃棒，不銹鋼燒杯，250ml的三角瓶，紗布，報(bào)紙，棉線，電爐，電磁爐，帶塞比色管，試管架，漏斗，1ml、5ml移液管，洗瓶，廢液瓶，蒸餾水，濾紙，比色皿，取液器，槍盒，槍頭，酒精燈，打火機(jī)，振蕩培養(yǎng)箱，分光光度計(jì)，水浴鍋等。四、實(shí)驗(yàn)方法1、菌種活化：將保藏的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h；2、種子液制備：取一環(huán)活化

3、的菌種接入裝量為50mL的種子培養(yǎng)基，37℃，180rpm培養(yǎng)18h；3、接種培養(yǎng)：分別取2ml種子液，接入到發(fā)酵培養(yǎng)集中固定置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，32℃，160rpm培養(yǎng)48h.1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml帶塞比色管中，分別準(zhǔn)確加入DNS試劑2ml，沸水浴加熱2min，流水冷卻，用水補(bǔ)足到15ml刻度。在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。2、發(fā)酵液：取發(fā)酵液5ml，過(guò)濾，備用；3、DNS測(cè)定：取發(fā)酵濾液適當(dāng)稀釋，使糖濃度為0.1-1.0mg/

4、ml，取稀釋后的糖液1.0ml于15ml刻度試管中，加DNS試劑2.0ml，沸水煮沸2min，冷卻后用水補(bǔ)足到15ml刻度，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖mg/ml數(shù)。求出樣品中糖含量；4、α-淀粉酶活性的測(cè)定：吸取20.0ml可溶性淀粉溶液于試管中，加入5.0ml緩沖液搖勻后，于60±0.2℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。加入稀釋好的待測(cè)酶液1.0ml，立刻計(jì)時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min。立即吸取1.0ml反應(yīng)液，加到預(yù)先盛有0.5ml鹽酸溶液（0.1mol/ml）和5.0ml稀碘液中，搖勻，并以0.5ml

5、鹽酸溶液（0.1mol/ml）和5.0ml稀碘液作空白，于660nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿迅速測(cè)定其吸光度（A），根據(jù)其吸光度查表（見表1），求得測(cè)試酶液的濃度（cU/ml）.5、淀粉酶效價(jià)測(cè)定：（1）配制淀粉培養(yǎng)基，2%淀粉，2%瓊脂；（2）水解淀粉圈實(shí)驗(yàn)：用打孔器在平皿中央打孔，取0.1ml不同時(shí)間取樣的發(fā)酵液于孔中，最后將平皿放置于30℃左右培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。一、結(jié)果與分析1、根據(jù)該實(shí)驗(yàn)，查閱資料，寫出一種適合該發(fā)酵液中淀粉酶提取的實(shí)驗(yàn)方案。2、記錄0，12，24，36，48小時(shí)各時(shí)間段，pH、DNS、酶活值，

6、分別以表格和圖形形式表示。3、繪制淀粉酶效價(jià)（透明圈直徑表示）變化曲線。4、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果DNS試劑：酒石酸鉀鈉18.2g，溶于50ml蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100ml，貯于棕色瓶中，室溫保存但是一定要注意，3，5-二硝基水楊酸和NaOH的加入時(shí)間一定要很近，或者是先加入NaOH。否則會(huì)產(chǎn)生難溶的沉淀，導(dǎo)致配制溶液失敗。且配置過(guò)程中，溶液加熱溫度不宜超過(guò)50攝氏度。pH6.0的磷酸緩沖液：稱取45.23g磷酸氫二鈉（N

7、a2HPO4·12H2O）和8.07g檸檬酸（C6H8O7·H2O），用水溶解并定容至1000mL。用pH計(jì)校正后使用。原碘液：稱取11.0g碘和22.0碘化鉀，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，貯存于棕色瓶中。稀碘液：吸取原碘液2.00ml，加20.0g碘化鉀用水溶解并定容至500ml，貯存于棕色瓶中?？扇苄缘矸廴芤海?0g/L）：稱取2.000g（精確至0.001g）可溶性淀粉（以絕干計(jì)）于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明

8、，冷卻定容至100mL。溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。（注：可溶性淀粉就采用湖州展望化學(xué)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的酶制劑專用可溶性淀粉。）DNS法測(cè)還原糖：DNS即二硝基水楊酸法是利用堿性條件下，二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成