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《耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì).doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)綜述：耐高溫α-淀粉酶通常采用地衣芽孢桿菌經(jīng)深層培養(yǎng)、提取等工序精制而成，能隨機(jī)水解淀粉、糖原及其降解物內(nèi)部的α-1.4葡萄糖苷健。使得膠狀淀粉溶液的粘度迅速下降，變成液化淀粉并裂解產(chǎn)生可溶性糊精和寡聚糖，過(guò)度的水解可產(chǎn)生少量葡萄糖和麥芽糖。其液體產(chǎn)品外觀呈棕褐色液體,易溶于水,密度為1.15-1.25g/ml。耐高溫α-淀粉酶穩(wěn)定的pH范圍為5.0～10.0,有效的pH范圍為5.0～8.0。最適pH范圍為5.5～7.0,最佳pH范圍為6.0～6.2,在淀粉糖化和味精行業(yè)生產(chǎn)中均采用的pH范圍為6.0～6.2。耐高溫淀粉
2、酶在90-95℃范圍內(nèi)非常穩(wěn)定,淀粉進(jìn)行噴射液化迅速快捷、完全徹底。在噴射液化工藝中瞬間溫度達(dá)105-110℃，仍能有效水解淀粉。耐高溫α-淀粉酶制劑為有機(jī)生化物質(zhì)，在較低濃度的鈣離子存在的情況下有很好的穩(wěn)定性。對(duì)于淀粉的水解，推薦加入50-100ppm鈣離子，因此常采用添加自來(lái)水的方法提供鈣源。日光、溫度、濕度易引起酶失活，銅、鈦、鈷等金屬離子對(duì)本品也有一定影響，鉛、鋁、鋅等金屬離子對(duì)該試劑有較強(qiáng)的抑制作用。耐高溫α-淀粉酶具有極好的耐熱性，能廣泛應(yīng)用于淀粉、酒精、啤酒、味精、釀造、紡織退漿等工業(yè)上。近年來(lái)隨著雙酶法制糖工藝在糧食深加工領(lǐng)域的成功應(yīng)用,該工藝
3、給發(fā)酵工業(yè)諸如啤酒工業(yè)、酒精工業(yè)、味精工業(yè)、酵母工業(yè)、檸檬酸工業(yè)、抗菌素工業(yè)等帶來(lái)的巨大的經(jīng)濟(jì)效益。這也使得耐高溫α-淀粉酶作為一種新型酶制劑得到廣泛的應(yīng)用，且有著良好的發(fā)展前景。目前一般企業(yè)生產(chǎn)的酶制劑耐高溫α-淀粉酶酶活在40000u/ml左右，完全可以滿足實(shí)際生產(chǎn)中淀粉液化的要求。但是傳統(tǒng)在采用地衣芽孢桿菌、米曲霉深層培養(yǎng)發(fā)酵得到發(fā)酵液中酶活較低，酶活最高僅達(dá)到7500u/ml。采用轉(zhuǎn)基因畢赤氏酵母工程菌生產(chǎn)可以提高發(fā)酵液中酶活達(dá)到25000u/ml。畢赤氏酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一，它操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量高,有著大腸桿菌表達(dá)系
4、統(tǒng)和其它酵母表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法比擬的優(yōu)越之處。為尋求適于工業(yè)生產(chǎn)的耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵條件,有必要經(jīng)過(guò)一系列的技術(shù)方法改造獲得真正意義的用于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株生物技術(shù)便是手段之一。本實(shí)驗(yàn)利用山東大學(xué)提供的轉(zhuǎn)地衣芽抱桿菌耐高溫α-淀粉酶基因的重組畢赤酵母基因工程菌。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件來(lái)提高酶產(chǎn)量和酶活性,降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件提高耐高溫α-淀粉酶在基因工程菌中的表達(dá)，分泌?，F(xiàn)階段在推薦的培養(yǎng)條件下采用本菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)得酶活為5.8-48u/ml。通過(guò)不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件，使酶活目標(biāo)達(dá)到100-
5、200u/ml。2通過(guò)優(yōu)化分離提取方法提高酶產(chǎn)量和酶活力。3進(jìn)行初步的擴(kuò)大培養(yǎng)，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。二、實(shí)驗(yàn)原理：畢赤氏酵母不僅能以甲醇作為唯一能源和碳源,而且在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)異常迅速,可進(jìn)行高密度連續(xù)培養(yǎng),當(dāng)畢赤氏酵母從非誘導(dǎo)的葡萄糖培養(yǎng)基或甘油培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)型的甲醇培養(yǎng)基上時(shí),會(huì)大量合成甲醇氧化酶,并在微體中以晶體(非溶蛋白)形式積聚。這一特點(diǎn)對(duì)外源蛋白融合表達(dá)十分有利,可使它們免受蛋白酶降解且對(duì)宿主細(xì)胞不產(chǎn)生毒害作用。典型的轉(zhuǎn)基因畢赤氏酵母工程菌表達(dá)載體內(nèi)含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列(5'AOX1啟動(dòng)子、3'AOX1終止序列、3'AOX1序列),
6、其中含多克隆位點(diǎn)(MCS)供外源基因插入。以巴斯德畢赤氏酵母組氨醇脫氫酶基因(HIS4)作為互補(bǔ)性篩選標(biāo)志，一般在載體中還包含有某個(gè)抗生素抗性基因如AmpR、KanR等。為了更有利于外源蛋白生產(chǎn)的下游加工,構(gòu)建了畢赤氏酵母的分泌型表達(dá)載體。它是在一般胞內(nèi)融合表達(dá)載體的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)分泌信號(hào)序列,位于5'AOX1與MCS之間。在這個(gè)分泌信號(hào)的引導(dǎo)下,導(dǎo)入外源基因的畢赤氏酵母可以以甲醇作為唯一碳源,進(jìn)行快速繁殖生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低至0.1g/ml時(shí)，畢赤氏酵母會(huì)啟用甲醇作為能量。此時(shí)AOX基因被激活，AOX所在的質(zhì)粒得到翻譯表達(dá)，菌體開(kāi)始產(chǎn)生并分泌耐高
7、溫α-淀粉酶。三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：菌種：轉(zhuǎn)基因畢赤氏酵母菌試劑：糖蜜PTM1甲醇磷酸緩沖液（PH6.0）尿素甘油硫酸鉀七水合硫酸鎂鹽酸稀碘液等儀器：分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽滅菌鍋，搖床，無(wú)菌超凈工作臺(tái)，冰箱，離心機(jī)，紗布等四、實(shí)驗(yàn)流程（1）目的菌株的選取：本實(shí)驗(yàn)采用山東大學(xué)提供的目的轉(zhuǎn)基因畢赤氏酵母菌，從地衣芽孢桿菌基因庫(kù)中分離得到轉(zhuǎn)錄翻譯成耐高溫α-淀粉酶的目的基因，通過(guò)重組DNA技術(shù)將此目的基因通過(guò)重組質(zhì)粒的形式轉(zhuǎn)移到畢赤氏酵母體內(nèi)得到的轉(zhuǎn)基因工程菌株。然后在抗生素培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)錄進(jìn)外源基因的畢赤氏酵母才能存活并生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培
8、養(yǎng)后，從該培養(yǎng)基上挑取單菌落移至斜面培
