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《耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化實驗方案設計.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化實驗方案設計綜述：耐高溫α-淀粉酶通常采用地衣芽孢桿菌經(jīng)深層培養(yǎng)、提取等工序精制而成，能隨機水解淀粉、糖原及其降解物內部的α-1.4葡萄糖苷健。使得膠狀淀粉溶液的粘度迅速下降，變成液化淀粉并裂解產(chǎn)生可溶性糊精和寡聚糖，過度的水解可產(chǎn)生少量葡萄糖和麥芽糖。其液體產(chǎn)品外觀呈棕褐色液體,易溶于水,密度為1.15-1.25g/ml。耐高溫α-淀粉酶穩(wěn)定的pH范圍為5.0～10.0,有效的pH范圍為5.0～8.0。最適pH范圍為5.5～7.0,最佳pH范圍為6.0～6.2,在淀粉糖化和味精行業(yè)生產(chǎn)中均采用的pH范圍為6.0～6.2。耐高溫淀粉
2、酶在90-95℃范圍內非常穩(wěn)定,淀粉進行噴射液化迅速快捷、完全徹底。在噴射液化工藝中瞬間溫度達105-110℃，仍能有效水解淀粉。耐高溫α-淀粉酶制劑為有機生化物質，在較低濃度的鈣離子存在的情況下有很好的穩(wěn)定性。對于淀粉的水解，推薦加入50-100ppm鈣離子，因此常采用添加自來水的方法提供鈣源。日光、溫度、濕度易引起酶失活，銅、鈦、鈷等金屬離子對本品也有一定影響，鉛、鋁、鋅等金屬離子對該試劑有較強的抑制作用。耐高溫α-淀粉酶具有極好的耐熱性，能廣泛應用于淀粉、酒精、啤酒、味精、釀造、紡織退漿等工業(yè)上。近年來隨著雙酶法制糖工藝在糧食深加工領域的成功應用,該工藝
3、給發(fā)酵工業(yè)諸如啤酒工業(yè)、酒精工業(yè)、味精工業(yè)、酵母工業(yè)、檸檬酸工業(yè)、抗菌素工業(yè)等帶來的巨大的經(jīng)濟效益。這也使得耐高溫α-淀粉酶作為一種新型酶制劑得到廣泛的應用，且有著良好的發(fā)展前景。目前一般企業(yè)生產(chǎn)的酶制劑耐高溫α-淀粉酶酶活在40000u/ml左右，完全可以滿足實際生產(chǎn)中淀粉液化的要求。但是傳統(tǒng)在采用地衣芽孢桿菌、米曲霉深層培養(yǎng)發(fā)酵得到發(fā)酵液中酶活較低，酶活最高僅達到7500u/ml。采用轉基因畢赤氏酵母工程菌生產(chǎn)可以提高發(fā)酵液中酶活達到25000u/ml。畢赤氏酵母表達系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀應用最廣泛的外源基因表達系統(tǒng)之一，它操作簡單、表達量高,有著大腸桿菌表達系
4、統(tǒng)和其它酵母表達系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)越之處。為尋求適于工業(yè)生產(chǎn)的耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌及其發(fā)酵條件,有必要經(jīng)過一系列的技術方法改造獲得真正意義的用于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株生物技術便是手段之一。本實驗利用山東大學提供的轉地衣芽抱桿菌耐高溫α-淀粉酶基因的重組畢赤酵母基因工程菌。通過優(yōu)化發(fā)酵條件來提高酶產(chǎn)量和酶活性,降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎。實驗方案設計一、實驗目的：1通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高耐高溫α-淀粉酶在基因工程菌中的表達，分泌。現(xiàn)階段在推薦的培養(yǎng)條件下采用本菌種進行搖瓶發(fā)酵實驗，測得酶活為5.8-48u/ml。通過不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件，使酶活目標達到100-
5、200u/ml。2通過優(yōu)化分離提取方法提高酶產(chǎn)量和酶活力。3進行初步的擴大培養(yǎng)，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。二、實驗原理：畢赤氏酵母不僅能以甲醇作為唯一能源和碳源,而且在甲醇培養(yǎng)基中生長異常迅速,可進行高密度連續(xù)培養(yǎng),當畢赤氏酵母從非誘導的葡萄糖培養(yǎng)基或甘油培養(yǎng)基轉移到誘導型的甲醇培養(yǎng)基上時,會大量合成甲醇氧化酶,并在微體中以晶體(非溶蛋白)形式積聚。這一特點對外源蛋白融合表達十分有利,可使它們免受蛋白酶降解且對宿主細胞不產(chǎn)生毒害作用。典型的轉基因畢赤氏酵母工程菌表達載體內含有醇氧化酶基因的調控序列(5'AOX1啟動子、3'AOX1終止序列、3'AOX1序列),
6、其中含多克隆位點(MCS)供外源基因插入。以巴斯德畢赤氏酵母組氨醇脫氫酶基因(HIS4)作為互補性篩選標志，一般在載體中還包含有某個抗生素抗性基因如AmpR、KanR等。為了更有利于外源蛋白生產(chǎn)的下游加工,構建了畢赤氏酵母的分泌型表達載體。它是在一般胞內融合表達載體的基礎上增加了一個分泌信號序列,位于5'AOX1與MCS之間。在這個分泌信號的引導下,導入外源基因的畢赤氏酵母可以以甲醇作為唯一碳源,進行快速繁殖生長。當培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低至0.1g/ml時，畢赤氏酵母會啟用甲醇作為能量。此時AOX基因被激活，AOX所在的質粒得到翻譯表達，菌體開始產(chǎn)生并分泌耐高
7、溫α-淀粉酶。三、實驗器材及試劑：菌種：轉基因畢赤氏酵母菌試劑：糖蜜PTM1甲醇磷酸緩沖液（PH6.0）尿素甘油硫酸鉀七水合硫酸鎂鹽酸稀碘液等儀器：分光光度計，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽滅菌鍋，搖床，無菌超凈工作臺，冰箱，離心機，紗布等四、實驗流程（1）目的菌株的選?。罕緦嶒灢捎蒙綎|大學提供的目的轉基因畢赤氏酵母菌，從地衣芽孢桿菌基因庫中分離得到轉錄翻譯成耐高溫α-淀粉酶的目的基因，通過重組DNA技術將此目的基因通過重組質粒的形式轉移到畢赤氏酵母體內得到的轉基因工程菌株。然后在抗生素培養(yǎng)基上進行選擇性培養(yǎng)，只有轉錄進外源基因的畢赤氏酵母才能存活并生長。經(jīng)過一段時間培
8、養(yǎng)后，從該培養(yǎng)基上挑取單菌落移至斜面培
