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1、嵌合體防齲疫苗的研究進(jìn)展摘要 嵌合體防齲疫苗是將變鏈球菌的毒力因子葡糖基轉(zhuǎn)移酶和表面蛋白，或分別與霍亂毒素亞單位相嵌合，依據(jù)嵌合方式不同，分化學(xué)嵌合、基因工程嵌合、直接嵌合基因免疫。對(duì)不同方式嵌合防齲疫苗的研究，有助于比較疫苗的有效性，為免疫防齲提供理論依據(jù)?！ ∏逗象w疫苗是指兩個(gè)及兩個(gè)以上的抗原蛋白通過化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合，或間接通過基因工程方法獲得嵌合抗原蛋白，以及運(yùn)用含有嵌合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒直接免疫，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多種抗原的保護(hù)性免疫。變鏈球菌是主要致齲菌，其重要毒力因子為葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferases,GTFs）和表現(xiàn)蛋白。GTFs和表現(xiàn)蛋白具有良好的免疫原
2、性和免疫反應(yīng)性，是目前研究防齲疫苗較理想的抗原蛋白?？谇恢械目贵w主要來自唾液腺的S-IgA和少量的血清IgG,S-IgA的形成需通過共同粘膜免疫系統(tǒng)。在機(jī)體的粘膜組織附近分布著大量的淋巴組織，這些粘膜相關(guān)淋巴組織在刺激部位接受抗原刺激后，致敏淋巴組織通過游走，歸巢而達(dá)到其他部位的粘膜組織，即效應(yīng)部位，并合成、分泌特異抗體。誘發(fā)粘膜免疫，產(chǎn)生高效、持久的S-IgA是近來嵌合體防齲疫苗研究的主要方向。本文依據(jù)獲得嵌合體抗原蛋白的不同方式，分別概述嵌合體防齲疫苗的研究現(xiàn)狀。 1變鏈球菌表面蛋白（AgⅠ/Ⅱ）與霍亂毒素B亞單位（choleratoxinBsubunit,CTB）嵌合疫苗 近年
3、來研究發(fā)現(xiàn)，CTB是有很強(qiáng)的粘膜免疫增強(qiáng)作用，不少學(xué)者將AgⅠ/Ⅱ與CTB化學(xué)偶聯(lián)，以此嵌合體免疫動(dòng)物，獲得了明顯的防齲效果.?！ gⅠ/Ⅱ包括兩個(gè)重復(fù)氨基酸序列，一個(gè)位于N端，富含丙氨酸，稱A區(qū)，又稱唾液成分結(jié)合區(qū)（salivabindingregion,SBR），一個(gè)位于C端，富含脯氨酸[4]?；魜y毒素由B亞單位和A亞單位構(gòu)成，其中A亞單位由兩段肽構(gòu)成，A1為毒性亞單位，A2與A1和B之間起橋梁聯(lián)接作用。B亞單位與哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜成分GM1神經(jīng)節(jié)苷脂有強(qiáng)親和力，是其作為粘膜免疫佐劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前AgⅠ/Ⅱ與CTB化學(xué)偶聯(lián)的方法是CTB和AgⅠ/Ⅱ分別與N-Succinimidyl(
4、3-[2-Pyriyl]-dithio)propionate(SPDP)結(jié)合，形成CTB-SPDP，AgⅠ/Ⅱ－SPDP,在室溫又與二硫蘇糖醇混合，再經(jīng)還原和平衡過柱，獲得的AgⅠ/Ⅱ溶液與等摩爾的CTB-SPDP混合，最后經(jīng)透析得到AgⅠ/Ⅱ-CTB嵌合蛋白。通過ELISA證實(shí)嵌合體結(jié)合GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的能力及AgⅠ/Ⅱ的免疫活性[5]。Katz用相同方法獲得的AgⅠ/Ⅱ-CTB經(jīng)鼻腔免疫的Fischer鼠，與經(jīng)口感染變鏈菌的相同鼠為對(duì)照，經(jīng)ELISA測(cè)定，免疫組抗AgⅠ/Ⅱ的S-IgA為對(duì)照組的4倍，且免疫組小鼠下頜牙菌斑中的變鏈菌和齲均明顯低于對(duì)照組[6]。同樣Russell用Ag
5、Ⅰ/Ⅱ-CTB經(jīng)口免疫大鼠，經(jīng)2-3次免疫，鼠產(chǎn)生抗AgⅠ/Ⅱ的S-IgA，至5-6月時(shí)仍能用ELISA檢測(cè)出S-IgA[7]?！ ? 因工程嵌合疫苗 2.1 AgⅠ/ⅡA區(qū)與GTFs基因工程嵌合疫苗 GTFs是由1500個(gè)氨基酸組成的具有高度同源序列的蛋白質(zhì)，其N端為蔗糖結(jié)合區(qū)（sucrosebinding,SB）,C端為葡聚糖結(jié)合區(qū)（glucanbinding,GB）[8]。Yu等[9]用基因重組方法獲得了AgⅠ/Ⅱ的A區(qū)與GTF的SB區(qū)或GB區(qū)嵌合的抗原蛋白，方法為：經(jīng)PCR分別獲得編碼GTF-SB區(qū)、GTF-GB區(qū)和AgⅠ/Ⅱa區(qū)的基因，分別將編碼GTF-GB區(qū)段和GTF-S
6、B區(qū)段的基因插入質(zhì)粒pBluescriptⅡ3，得到質(zhì)粒pBlueGB、pBlueSB，編碼AgⅠ/ⅡA區(qū)的基因插入質(zhì)粒pACA202。質(zhì)粒pBluegB，pBlueSB以相同內(nèi)切酶酶切，分別插入pACA202得到含有嵌合基因的質(zhì)粒，再插入原核表達(dá)質(zhì)粒，最后得到含有嵌合基因AgⅠ/ⅡA區(qū)-GB，AgⅠ/ⅡA區(qū)-SB的表達(dá)質(zhì)粒pQEPG22,pQEPG23,轉(zhuǎn)染E.colix-li-Blue。得到的表達(dá)產(chǎn)物免疫兔后發(fā)現(xiàn)，用AgⅠ/ⅡA區(qū)-GB免疫產(chǎn)生的IgG既能抑制葡聚糖的合成，又能抑制變鏈菌對(duì)唾液包被的羥基磷灰古的非蔗糖依賴型粘附。而用AgⅠ/ⅡA區(qū)-SB免疫產(chǎn)生的抗體不能抑制葡聚糖的合
7、成，只能抑制非蔗糖依賴型粘附。推測(cè)可能是抗AgⅠ/ⅡA-SB的抗體不能進(jìn)入結(jié)合GTFs的催化區(qū)，或不能識(shí)別GTFs的構(gòu)象[10]?！ ?.2 GTF-SB區(qū)與CTB基因工程嵌合疫苗 1996年，Laloi[11]先人工合成編碼GTF的SB區(qū)基因的寡核苷酸序列，將此序列插入質(zhì)粒pVA1542（不含啟動(dòng)子，含ctb基因），得到含有編碼SB-CTB基因的嵌合質(zhì)粒，最后將此嵌合基因插入帶有啟動(dòng)子的表達(dá)載體pT-7-7，構(gòu)建出表達(dá)載體PT7
