重組人生長激素在體外對人胃癌細(xì)胞作用的研究

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1、重組人生長激素在體外對人胃癌細(xì)胞作用的研究【摘要】目的:研究重組人生長激素(rhGH)在體外對胃癌細(xì)胞生長的影響。方法:設(shè)對照組、rhGH組、5氟尿嘧啶組和rhGH加5FU組共4組，依rhGH濃度不同，rhGH和rhGH加5FU組又各分4個亞組。利用體外細(xì)胞培養(yǎng)、MTT比色、流式細(xì)胞儀及免疫細(xì)胞化學(xué)等方法,測定不同濃度的rhGH對人胃癌細(xì)胞株MGC803腫瘤抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖指數(shù)及核增殖抗原Ki67表達(dá)的影響。結(jié)果:rhGH在體外無明顯促進(jìn)MGC803細(xì)胞分裂增殖作用；對照組與各rhGH組比較，腫瘤抑制率、PI、Ki67表達(dá)強度差異均無顯著性(P>)；rh

2、GH各亞組間比較差異亦無顯著性；5FU組與rhGH組及對照組比較，各rhGH加5FU組與rhGH組及對照組比較細(xì)胞抑制率增加,阻滯于G0～G1期的細(xì)胞數(shù)增加，S期細(xì)胞明顯減少，PI明顯降低(P【關(guān)鍵詞】胃癌；細(xì)胞周期；核增殖抗原；生長激素，人生長激素具有直接的代謝調(diào)理作用，能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增加脂肪氧化分解和糖異生，提高糖利用及營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換率，同時提高1,25(OH)2VitD3水平，增加腸道對鈣和磷的吸收。近年來，重組人生長激素已經(jīng)在改善高分解代謝狀態(tài)患者的營養(yǎng)狀況、糾正負(fù)氮平衡、促進(jìn)傷口愈合及提高手術(shù)耐受性等方面得到廣泛應(yīng)用。GH糾正負(fù)氮平衡及調(diào)節(jié)免疫的作用，可用

3、于晚期腫瘤患者以逆轉(zhuǎn)其惡液質(zhì)狀態(tài)，但GH可能的促腫瘤細(xì)胞增殖作用限制了其在腫瘤患者中的應(yīng)用。本實驗旨在通過體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察rhGH對人低分化胃黏液腺癌細(xì)胞MGC803生長的影響，為rhGH能否用于臨床胃癌患者提供實驗基礎(chǔ)。1材料與方法主要試劑及儀器rhGH，5氟尿嘧啶，RPMI1640(美國GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)，流式細(xì)胞儀(FACScalibur型，美國BD公司)，一抗Ki67、即用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑，人低分化胃黏液腺癌細(xì)胞株MGC803。實驗分組本實驗設(shè)對照組、5FU組、rhGH組和rhGH加5

4、FU組共4組，后兩組根據(jù)rhGH濃度不同又分為1～4個亞組，rhGH濃度依次為50、100、200及400ng·ml-1。細(xì)胞培養(yǎng)MGC803細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液(含青霉素100U·ml-1,鏈霉素100U·ml-1)中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用%胰蛋白酶消化，用g·L-1臺盼藍(lán)染色后計算細(xì)胞存活率，并行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×10ml-1備用。MTT比色法檢測癌細(xì)胞活性將單細(xì)胞懸液接種于96孔板，200μl·孔-1，每組設(shè)4個復(fù)孔。24h細(xì)胞完全貼壁后吸出各孔培養(yǎng)液，加入受試藥物，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h

5、以檢測各組細(xì)胞抑制率，另用同樣方法培養(yǎng)0、24、48、72h以繪制細(xì)胞生長曲線。實驗終止前4h加入MTT液20μl·孔-1，實驗結(jié)束后傾去藥液及培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，平板震蕩儀震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570nm波長處測定各孔光密度值，然后按下式計算細(xì)胞抑制率和生長率：抑制率=(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%；生存率=實驗組平均OD值/對照組平均OD值×100%。流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖指數(shù)各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后消化、離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，獲取1×10ml-1以上的細(xì)胞，將收集標(biāo)本熒光素(碘化丙錠)染色20min，

6、用激發(fā)波長為488nm、接受波長為575nm的流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。根據(jù)細(xì)胞周期分析結(jié)果，按下式計算PI：PI=/(G0～G1期細(xì)胞＋S期細(xì)胞＋G2～M期細(xì)胞)×100％。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各組細(xì)胞核增殖抗原Ki67的表達(dá)在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，加入各組受試藥物，培養(yǎng)48h后取出玻片。冷丙酮固定10min后，采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物連接(SP)免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。Ki67以1∶50稀釋。根據(jù)陽性細(xì)胞著色面積和著色強度積分，應(yīng)用Imageproplus圖像分析軟件進(jìn)行分析，每組選取10個高倍鏡視野，用平均光強度表示

7、Ki67相對表達(dá)量。統(tǒng)計學(xué)處理所有資料均用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果.1細(xì)胞抑制率及細(xì)胞生長曲線.細(xì)胞抑制率培養(yǎng)48h所得的實驗各組OD值見表1。由表1可見，各rhGH組與對照組、各rhGH加5FU組與5FU組、各rhGH組內(nèi)及各rhGH加5FU組內(nèi)比較，細(xì)胞抑制率和生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>)；各rhGH加5FU組、5FU組分別與對照組比較細(xì)胞生長抑制率明顯增加，生存率明顯下降(P.細(xì)胞生長曲線對照組與各rhGH組比較生長曲線無明顯變化，各r