SNT1395.1-2004禽衣原體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法.pdf

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1、SN中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1395.1-2004禽衣原體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法Protocolofindirecthemagglutinationtestforavianchlamydiosis2004-06-01發(fā)布2004-12-01實(shí)施中華人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局SN/T1395.oli舌本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A是規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中華人民共和國(guó)廣東出人境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:梁剛、張?jiān)茦?、陳澤華。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出人境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。SN/T1395.1-2

2、004禽衣原體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽衣原體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽衣原體病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)測(cè)。2采樣本試驗(yàn)檢測(cè)樣品為禽鳥類動(dòng)物血清。樣品應(yīng)無(wú)菌采集，且不溶血、不腐敗。樣品4℃時(shí)可保存5d,長(zhǎng)期存樣應(yīng)一18℃冷藏保存，試驗(yàn)前56℃水浴滅能30min-35min.材料3.1器材恒溫水浴箱，96孔V型微量反應(yīng)板，25tcL,50IL微量移液器，微量振蕩器，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，高壓消毒器，臺(tái)式離心機(jī)，離心管。3.2稀釋液含1%滅能兔血清的pH7.0磷酸緩沖液(PBS)，配制方法見附錄A，或按診斷試劑說(shuō)明書配制。3.3診斷試

3、劑敏化紅細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。4方法每份被檢血清倍比稀釋至第6孔，每次檢測(cè)設(shè)一對(duì)照試驗(yàn)組，包括敏化紅細(xì)胞空白對(duì)照、陽(yáng)性及陰性血清對(duì)照試驗(yàn)，試驗(yàn)操作程序見表1,表1禽衣原體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)操作程序及結(jié)果判定舉例被檢血清稀釋度各項(xiàng)對(duì)照試驗(yàn)成分陽(yáng)性血陰性血1‘21:41:81:161，321:64空白對(duì)照清對(duì)照清對(duì)照稀釋液/pL5050t50L50U50七50七50飛_s)O一F-50)一=501一1--50J一v50)一~501丫被檢血清/t,L棄去50陽(yáng)性對(duì)照50血清/pL陰性對(duì)照50血清/pL敏化紅252525252525252525細(xì)胞/yL

4、置反應(yīng)板于微量振蕩器上振蕩1min.37℃或室溫感作結(jié)果判+++++十+十+++++++++++++定舉例注:所示被檢血清紅細(xì)胞凝集效價(jià)為1，32SN/T1395.1-2004被檢血清檢測(cè)程序如下:—每孔滴加稀釋液50IL;—將被檢血清50pL加人第1孔，依次作倍比稀釋至第6孔，最后棄去50pL;—每孔加人敏化紅細(xì)胞25IL;—置反應(yīng)板于微量振蕩器上振蕩1min,混勻;-4lAV板加蓋,37℃或室溫感作30min-120min，以對(duì)照孔出現(xiàn)結(jié)果時(shí)判讀，結(jié)果判定5.1凝集程度的判別標(biāo)準(zhǔn)和紅細(xì)胞凝集效價(jià)5.1.1凝集程度的判別標(biāo)準(zhǔn)+++十:紅細(xì)胞全部凝集，成一均

5、勻的膜，布滿整個(gè)孔底。+++:紅細(xì)胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者小。++:紅細(xì)胞在孔底形成薄層凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀。+:紅細(xì)胞在孔底呈小圓點(diǎn)，周圍有稀疏散在的少量凝集。士:紅細(xì)胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心有空斑。一:紅細(xì)胞完全沉于孔底，呈光滑的圓點(diǎn)。51.2紅細(xì)胞凝集效價(jià)被檢血清產(chǎn)生“++”紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的最高稀釋倍數(shù)為紅細(xì)胞凝集效價(jià)。5.2結(jié)果判定5.2.1對(duì)照試驗(yàn)5.2.1.1敏化紅細(xì)胞空白對(duì)照:應(yīng)無(wú)自凝現(xiàn)象，為(一)。5.2.1.2陽(yáng)性對(duì)照血清:應(yīng)為(++++)。5.2.1.3陰性對(duì)照血清:應(yīng)為(一)。5.2.2檢測(cè)判定被檢血清檢測(cè)結(jié)果按以下標(biāo)

6、準(zhǔn)判斷:—紅細(xì)胞凝集效價(jià)為1，16及以上，判為陽(yáng)性;—紅細(xì)胞凝集效價(jià)為1，4及以下，判為陰性;—紅細(xì)胞凝集效價(jià)介于兩者之間的，判為可疑。被檢血清如出現(xiàn)可疑結(jié)果的，應(yīng)作復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果仍為可疑的，判為陽(yáng)性。SN/T1395.1-2004附錄A(規(guī)范性附錄)稀釋液配制A.1pH7.0磷酸緩沖液(PBS)氯化鈉(NaCD4.25g磷酸氫二鈉(NazHPO<·12H}O)16.41g磷酸二氫鉀(KH2PO,)3.97g以上試劑應(yīng)選用分析純，將上述成分溶解于適量蒸餾水中，最后定容至1000mL,121V0.103MPa20min高壓滅菌，4℃保存，30d內(nèi)使用。A.2免

7、血清處理A.2.1綿羊紅細(xì)胞的制備取新鮮脫纖維或抗凝保存的綿羊紅細(xì)胞，用PBS1500r/min--2000r/min離心洗滌四次，每次PBS用量為紅細(xì)胞壓積的5倍以上，最后一次2000r/min離心10min，去除上清液，制得密集綿羊紅細(xì)胞。A.2.2免血清處理取三只以上健康家兔的血清混合，56℃水浴滅能30min.加人四分之一血清容積的密集綿羊紅細(xì)胞，混勻，37℃水浴60min，其間搖勻數(shù)次，40C過(guò)夜，次日離心除去紅細(xì)胞，-18℃冷藏保存?zhèn)溆?。A.3稀釋液配制mL經(jīng)處理的兔血清加人到99mL的PBS中，混勻即為本試驗(yàn)的稀釋液。稀釋液現(xiàn)配現(xiàn)用