間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲病

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1、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷血吸蟲病間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（Indirecthaemagglutinationtest,IHA）以紅細(xì)胞為載體吸附預(yù)先制備的特異性抗原或抗體作為試劑檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原血清學(xué)方法特點(diǎn)：抗原與其抗體之間的特異性反應(yīng)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象國外最早于1955年應(yīng)用于檢測馬抗血清國內(nèi)陶義訓(xùn)等（1958）首先應(yīng)用于診斷日本血吸蟲病楊贊元等（1976）應(yīng)用冰凍干燥方法制備試劑一、基本概念（一）凝集反應(yīng)是指細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原加入相應(yīng)抗體，并在適量電解質(zhì)存在的條件下，兩者特異性結(jié)合且進(jìn)一步凝聚成肉眼可見的小塊。凝集反應(yīng)分為直接凝集和間接凝集反應(yīng)。（二）間接紅細(xì)胞凝集試

2、驗(yàn)原理日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原載體顆粒綿羊、家兔、雞的紅細(xì)胞及O型人紅細(xì)胞致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3天致敏前將紅細(xì)胞醛化，可長期保存而不溶血常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛（三）間接血凝的類型IHA：用抗原致敏紅細(xì)胞檢測標(biāo)本中抗體反向間接血凝試驗(yàn)：用特異性抗體致敏紅細(xì)胞檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原間接血凝抑制試驗(yàn)反向間接血凝抑制試驗(yàn)（正向）間接凝集反應(yīng)反向間接凝集反應(yīng)間接凝集抑制反應(yīng)（一）血吸蟲蟲卵抗原制備分離蟲卵→脫水、脫酯干燥→研磨成細(xì)粉→凍融→超聲粉碎→普通離心→高速離心。經(jīng)離心后的上清液，即為蟲卵抗原原液，保存于-20℃中備用。二、凍干致敏

3、紅細(xì)胞的制備理想抗原敏感性高，特異性強(qiáng)，能區(qū)別不同感染度，能區(qū)別現(xiàn)在感染還是過去感染，價(jià)廉。但目前還沒有，今后可能依靠雜交瘤技術(shù)、DNA技術(shù)而獲得理想的抗原。取人“O”型血紅細(xì)胞3份（不同個(gè)體）混合，用生理鹽水洗滌。置冰浴內(nèi)，將戊二醛溶液慢慢滴入紅細(xì)胞懸液中，邊加邊搖，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸餾水配成10%的紅細(xì)胞懸液，置于4℃?zhèn)溆?。（二）紅細(xì)胞醛化醛化紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)克服了個(gè)體差異，保證實(shí)驗(yàn)重復(fù)性延長紅細(xì)胞的保存時(shí)間，在4℃可保存1年避免操作過程中因振蕩、低滲、凍融使紅細(xì)胞破裂、溶血取1/10000鞣酸溶液與等量2.5%紅細(xì)胞懸液混勻，置于37℃中15min，并不斷搖動(dòng)

4、。洗滌，去除多余的鞣酸。（三）紅細(xì)胞鞣化鞣化紅細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)鞣化后紅細(xì)胞易吸附蛋白抗原。取蟲卵抗原原液1:100稀釋，與2.5%的鞣化紅細(xì)胞等量混合，置于37℃水浴中30min，并不斷搖動(dòng)，然后離心，洗滌，去除多余抗原。用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃滅活）的pH7.2PBS保護(hù)液，配成10%濃度的致敏紅細(xì)胞懸液。致敏效果與抗原的活性及純度有關(guān)。（四）紅細(xì)胞致敏將上述致敏紅細(xì)胞懸液搖勻，分裝于2ml安瓿內(nèi)。每支0.4ml，立即放入-40℃冰箱冰凍，待全部分裝完畢后，移入冰凍干燥機(jī)內(nèi)，冰凍干燥約24h，干燥后封口，保存于4℃中備用。冰凍干燥具有高科技含量不是單純干燥，在冰凍狀態(tài)

5、下使水分子升華，不使紅細(xì)胞破裂，不影響抗原活性。（五）致敏紅細(xì)胞的冰凍干燥三、操作步驟（一）取生理鹽水2ml，加入裝有冰凍干燥紅細(xì)胞的安瓿中，配成2.0%的紅細(xì)胞懸液，搖勻。（二）在“V”型微量血凝反應(yīng)板的第1孔中加生理鹽水100μl,第2、3孔中各加25μl。（三）第1孔中加待檢血清25μl，混勻后吸出25μl加于第2孔中，在第2孔中混勻后，吸出25μl加于第3孔中，混勻后棄去25μl。此時(shí)第1、2、3孔中的血清稀釋度依次為1:5、1:10、1:20。（四）在第2、第3孔中各加致敏紅細(xì)胞懸液25μl，將反應(yīng)板放在振蕩器上振蕩1min，室溫下靜置45min，觀察反應(yīng)結(jié)果。四、反

6、應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)（一）陰性反應(yīng)：紅細(xì)胞全部下沉在凹底部，形成緊密的圓點(diǎn)，周圍整齊清晰。（二）陽性反應(yīng)：待檢者血清以1:10稀釋度出現(xiàn)凝集反應(yīng)為陽性起點(diǎn)（三）反應(yīng)強(qiáng)度“-”：紅細(xì)胞全部下沉在凹底部，形成緊密的圓點(diǎn)，周圍整齊清晰“+”：多數(shù)紅細(xì)胞下沉在凹底部形成圓點(diǎn)，周圍可見少量凝集紅細(xì)胞“++”：凹底部可見明顯的紅點(diǎn)，凝集紅細(xì)胞在底部形成小薄層“+++”：凹底部可見很弱的紅點(diǎn)，紅細(xì)胞呈疏松的顆粒凝集“++++”：紅細(xì)胞呈明顯的顆粒凝集，均勻散布于凹底部周圍形成薄層，有時(shí)呈皺褶狀效價(jià)(滴度)：發(fā)生凝集現(xiàn)象最高的血清稀釋度。五、影響因素及注意事（一）試劑：保存、對(duì)照、效價(jià)、搖勻。（二）反應(yīng)板：

7、“V”型，底角應(yīng)為90°。反復(fù)沖洗。（三）毛細(xì)吸管：校正、垂直。（四）血清樣本：新鮮為宜，保存在冰盒內(nèi)。溶血樣本將影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。（五）生理鹽水：用于稀釋IHA試劑、陽參、陰參、血清樣本的生理鹽水必須保持無菌。（六）判斷反應(yīng)結(jié)果：在判斷反應(yīng)結(jié)果時(shí)應(yīng)在反應(yīng)板下面襯一張白紙，使反應(yīng)結(jié)果更加清晰。先觀察空白對(duì)照、陰參、陽參，再觀察樣本。六、評(píng)價(jià)IHA的優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，陽性符合率在90%以上，對(duì)糞檢陽性者可高達(dá)95%，假陽性率一般不超過4%。操作方便，用血量少，便于現(xiàn)場使用。試劑生產(chǎn)方便，成本