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1、熒光PCR快速檢測試劑盒主要內(nèi)容基礎(chǔ)理論部分實驗操作部分注意事項及其他基礎(chǔ)理論部分基礎(chǔ)知識PCR原理與過程PCR體系熒光PCRPCR基礎(chǔ)1869年，核酸的概念Miescher從細(xì)胞核中提取到一種富含磷元素的酸性化合物…(DNA、RNA)1944年，核酸是遺傳物質(zhì)從S型肺炎球菌中提取的DNA與R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌轉(zhuǎn)化S型菌，且轉(zhuǎn)化率與DNA純度呈正相關(guān)，若將DNA預(yù)先用DNA酶降解，就不發(fā)生轉(zhuǎn)化1953年，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)岡崎片段DNA的半保留復(fù)制1971年，Khorana提出體外擴增設(shè)想1985年，Mullis發(fā)明PCR耐熱聚合酶PCR基礎(chǔ)Mullis發(fā)明PCR聚合酶鏈
2、式反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）實質(zhì)：體外模擬DNA的復(fù)制過程由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成變性：打開DNA螺旋雙鏈復(fù)性：引物與模板結(jié)合合成：Taq酶沿模板延伸PCR的原理①模板DNA雙鏈的打開（變性）：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，雙鏈解離成為單鏈，便于與引物結(jié)合②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：當(dāng)溫度降至55℃左右，單鏈模板DNA可與引物配對結(jié)合③引物引導(dǎo)下新鏈的合成（延伸）：DNA模板--引物復(fù)合體在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對原則合成一條新鏈Cycle1Cycle2Cycle3
3、動畫：PCR原理.swfPCR課件.swfPCR原理①變性溫度一般92oC-94oC,再高會縮短Taq酶半衰期 使用薄壁均勻離心管時間取決于模板的復(fù)雜程度，前期一般1~5min。GC%、空間結(jié)構(gòu)、雜蛋白等 循環(huán)中變性一般15~60sec。 對于模板沒有純化而擴增效果不好的，考慮延長變性時間 注：熱變性對DNA有重大的損傷，因此有時候變性時間長反而產(chǎn)物量會減少。PCR原理②退火因為引物>>模板，所以引物與模板配對的復(fù)性動力學(xué)系數(shù)遠(yuǎn)比模板復(fù)原的要大溫度37oC-65oC甚至72oC（兩步法）都有，視引物與模板的同源程度而定，一般使用比Tm值少5oC~10oC。如果引物與模板不是嚴(yán)緊配對
4、，一個堿基錯配約降低Tm5oC。 Tm計算經(jīng)驗公式：Tm=2（A+T）+4（G+C）時間15~60sec。PCR原理③延伸溫度一般在72oC，因為是Taq酶反應(yīng)最佳溫度時間按擴增區(qū)段（目標(biāo)產(chǎn)物大小）而定，一般15~60sec足夠。72oC時合成速度>1000bp/min Taq酶在70oC合成速度為60nt/sec 在55oC合成速度為24nt/sec 在37oC合成速度為1.5nt/sec 在22oC合成速度為0.25nt/sec 含有酶的反應(yīng)液操作最好在冰上進(jìn)行PCR反應(yīng)體系純水（補夠體積，使緩沖液為使用終濃度）10×反應(yīng)緩沖液（酶的作用環(huán)境）dNTP引物模板Taq酶探針（熒光
5、PCR）PCR反應(yīng)體系反應(yīng)緩沖液對于不同的模板引物，最佳緩沖條件有待摸索。常用50mmol/LKCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.3)、1.5mmol/LMgCl2。Tris-HCl在反應(yīng)中pH會有變化，△pKa為-0.021/oC50mmol/L內(nèi)的KCl有利于退火，高可能會抑制酶活 有些反應(yīng)使用NH4+代替K+(16mmol/L)PCR反應(yīng)體系反應(yīng)緩沖液Mg2+濃度影響引物退火和酶的活性，高M(jìn)g2+增強復(fù)性，也增加非特異性，降低模板變性溫度。Mg2+濃度>dNTP+模板+EDTA濃度 據(jù)報道，自由Mg2+濃度在0.7~0.8mM之間為好。 有報道使用Mn2+代替Mg
6、2+，但是會增加突變dNTP應(yīng)等濃度配置PCR反應(yīng)體系反應(yīng)緩沖液中可加一些PCR促進(jìn)劑 明膠TritonX-100穩(wěn)定酶的活性BSA DTT甘油DMSO降低解鏈溫度，提高反應(yīng)特異性 甲酰胺TMAC(氯化四甲基銨) gp32(T4噬菌體基因32蛋白)甜菜堿PCR反應(yīng)體系dNTP組成核酸長鏈的一個個小單元dATP，dGTP，dCTP，dTTP，dUTP…引物一小段單鏈DNA在Taq酶的作用下用于引導(dǎo)鏈的合成UNG酶在PCR產(chǎn)物或引物中用dU代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而
7、失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。引物設(shè)計引物設(shè)計的目標(biāo)是在擴增的特異性和擴增效率之間取得平衡①引物長度：15-30nt。引物越短，引物與靶DNA結(jié)合速率越大，確保Tm>=55oC的最短引物可獲得最好的效率和特異性，常用為18-24nt左右。如果擴增的序列具不均一性，引物長度應(yīng)長些，28-35nt。長引物多用于擴增蛋白異構(gòu)體或蛋白家族DNA；從不同物
