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1、全日制碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位（畢業(yè)）論文?？谔阋哞b別抗體膠體金免疫層析方法的建立學(xué)位申請(qǐng)人：唐欣浩指導(dǎo)教師：趙月蘭教授學(xué)位名稱(chēng)：獸醫(yī)碩士學(xué)科領(lǐng)域：不區(qū)分研究領(lǐng)域授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一八年六月三日分類(lèi)號(hào)：S855.3學(xué)校代碼：10086密級(jí)：公開(kāi)學(xué)號(hào)：20169200801牛口蹄疫鑒別抗體膠體金免疫層析方法的建立EstablishmentofColloidalGoldImmunochromatographicAssayforIdentifyingAntibodiestoFoot-and-MouthDiseaseinCattle學(xué)位申請(qǐng)人：唐欣浩指導(dǎo)教師：趙月蘭教授學(xué)位名稱(chēng)：獸醫(yī)碩士學(xué)
2、科領(lǐng)域：不區(qū)分研究領(lǐng)域授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一八年六月三日摘要口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD）是一種具有高度傳染性的疾病，它發(fā)病急，傳播快，易感動(dòng)物種類(lèi)多，主要侵害豬、牛、羊等經(jīng)濟(jì)價(jià)值大的牲畜和野生偶蹄獸，該病在世界流行廣泛，造成的影響也極為嚴(yán)重?？谔阋咭砸呙缑庖叻揽貫橹?，但臨床存在的自然感染和疫苗免疫現(xiàn)象，對(duì)該病的診斷帶來(lái)了極大的困難。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和世界口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室推薦使用的診斷方法在臨床中條件受限，不易操作，而膠體金免疫層析技術(shù)日益發(fā)展成熟，在獸醫(yī)臨床檢測(cè)應(yīng)用廣泛，它具有操作簡(jiǎn)便、用時(shí)短、結(jié)果直觀可靠、較高的靈敏性和特異性等
3、優(yōu)點(diǎn)，更適用于口蹄疫的臨床檢測(cè)。本試驗(yàn)利用DNAstar基因分析軟件分析、篩選、預(yù)測(cè)出口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC中抗原性強(qiáng)，疏水性好、表面可及性?xún)?yōu)良、柔韌性強(qiáng)的2段氨基酸，將其對(duì)應(yīng)的基因序列片段3ABCa和3ABCb，這2段基因之間用GSLinker序列連接，參考克隆載體的酶切位點(diǎn)并選定EcoRI和XhoI為酶切位點(diǎn)，將融合好的基因序列送與合成得到重組克隆載體pET28a-3ABCab。重組克隆載體存在于大腸桿菌DH-5α中，通過(guò)恒溫振蕩培養(yǎng)的方式對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)質(zhì)粒提取、雙酶切以及膠回收得到帶有粘性末端的目的基因3ABCab，將其與線性化表達(dá)載體pET-28a(+)進(jìn)行連接
4、得到重組原核表達(dá)載體pET28a-3ABCab，并將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS中。表達(dá)宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定方法摸索最適的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、鑒別是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)以及確定表達(dá)蛋白帶的大小為37.0kDa（含3.5kDa的pET-28a(+)肽段），與理論計(jì)算的目的蛋白大小一致。將鑒定正確的目的蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，并分離純化，透析復(fù)性，通過(guò)Weaternblot對(duì)純化蛋白的免疫學(xué)活性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明目的蛋白具有很好的免疫學(xué)活性，且融合基因能夠在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中獲得高效的重組表達(dá)。將獲得的重組表達(dá)蛋白3ABCab提純、
5、復(fù)性、濃縮后作為牛口蹄疫膠體金試紙條的檢測(cè)線的包被抗原劃線于NC膜上，葡萄球菌A蛋白(SPA)作為質(zhì)控線的包被抗體劃線于NC膜上，膠體金-SPA復(fù)合物噴涂到玻璃纖維素膜上制成金標(biāo)墊，將已處理好的試紙條各部分組裝制成?？谔阋呖贵w的膠體金免疫層析試紙條；用已制得試紙條檢測(cè)?？谔阋邩?biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，10-15min內(nèi)檢測(cè)線處出現(xiàn)紅色反應(yīng)條帶，質(zhì)控線也出現(xiàn)紅色反應(yīng)條帶，檢測(cè)陰性血清時(shí)試紙條檢測(cè)線未出現(xiàn)紅色反應(yīng)線，質(zhì)控線出現(xiàn)紅色反應(yīng)線，表明試紙條在檢測(cè)陽(yáng)性血清時(shí)呈陽(yáng)性反應(yīng)，檢測(cè)陰性血清時(shí)呈陰性反應(yīng)，并且結(jié)果有效；試紙條檢測(cè)線包被的抗原濃度為0.8mg/mL；試紙條檢測(cè)口蹄疫陰性血清，?？谔阋咭呙缑庖哧?yáng)
6、性血清、牛副結(jié)核病、牛病毒性腹瀉、牛布魯菌病、牛傳染性鼻氣管炎陽(yáng)性血清，結(jié)果都為陰性；用保存室溫6個(gè)月的試紙條與保存46℃?zhèn)€月的試紙條分別檢測(cè)牛口蹄疫陽(yáng)性和陰性血清、疫苗免疫陽(yáng)性血清，結(jié)果分別呈現(xiàn)陽(yáng)性和陰性、陰性。所制備的試紙條具有靈敏，特異可區(qū)分自然感染和免疫動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性好，15min內(nèi)出結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，可用于臨床診斷。關(guān)鍵詞：牛口蹄疫；膠體金；鑒別；免疫層析EstablishmentofColloidalGoldImmunochromatographicAssayforIdentifyingAntibodiestoFoot-and-mouthDiseaseinCattleAut
7、hor:TangXinhaoProfessor:ProfessorZhaoYuelanMaior:VeterinaryMedicineAbstractFoot-and-mouthdisease(FMD)isahighlycontagiousdisease.Ithasanacuteonset,rapidspread,andawiderangeofsusceptibleanimals.Itmainlyaffectspigs,cattle
