蛋白質含量測定方法比較

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1、[分享]蛋白質含量測定方法比較蛋白質,含量,測定蛋白質含量測定方法比較本實驗的目的是學會各種蛋白質含量的測定方法。了解各種測定方法的基本原理和優(yōu)缺點。蛋白質含量測定法，是生物化學研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret

2、法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，因為一種蛋白質溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質的性質；③溶液中存在的干擾物質；④測定所要花費的時間?？捡R斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應用。一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法樣品

3、與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：CH2COOH

4、+3H2SO4®2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4®(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH®2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反應（1）、(2)在凱氏瓶內完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。為了加速消化，可以加入CuS

5、O4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。五種蛋白質測定方法比較如下：方法靈敏度時間原理干擾物質說明凱氏定氮法（Kjedahl法）靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為±2％費時8～10小時將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離）用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；

6、費時太長雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低1～20mg中速20~30分鐘多肽鍵＋堿性Cu2＋®紫色絡合物硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似紫外吸收法較為靈敏50～100mg快速5～10分鐘蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin－酚試劑法（Lowry法）靈敏度高～5mg慢速40～60分鐘雙縮脲反應；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；

7、各種硫醇耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化考馬斯亮藍法(Bradford法)靈敏度最高1～5mg快速5～15分鐘考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS最好的方法；干擾物質少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質變化二、雙縮脲法（Biuret法）（一）實驗原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩

8、個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。H2OO=CC=OHNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色絡合物紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分

9、精確的蛋白質測定。（二）試劑與器材1.試劑：（1）標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。（2）雙縮脲試劑：稱以1.50