蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法比較

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1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定主要有五種方法，分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法。這五種方法各有特點(diǎn)，優(yōu)缺點(diǎn)明確。凱氏定氮法蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來(lái)乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。因?yàn)槭称分谐鞍踪|(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱(chēng)為粗蛋白。優(yōu)點(diǎn)：重現(xiàn)性好，是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法,是一種蛋白質(zhì)測(cè)定的經(jīng)典方法,,測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確。缺點(diǎn)：操作比較繁復(fù)，費(fèi)時(shí),試劑消

2、耗量大。且此法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量實(shí)際上包括了核酸，生物堿，含氮類(lèi)脂，卟啉，含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物。雙縮脲定氮法雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基

3、酸等。優(yōu)點(diǎn)：較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。缺點(diǎn)：不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。紫外吸收定氮法雙縮脲法是傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法,當(dāng)含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)和堿性的硫酸銅反應(yīng)時(shí),形成紫色的絡(luò)合物,這個(gè)顏色產(chǎn)物是肽鍵中的氮原子和銅離子配價(jià)結(jié)合的結(jié)果。蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。形成顏色產(chǎn)物的量取決于蛋白質(zhì)的濃度。實(shí)際測(cè)定時(shí),必須預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(xiàn),通

4、常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液加入雙縮脲試劑后,反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對(duì)照。然后將測(cè)得的值分別對(duì)蛋白濃度(mg/ml)作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理,根據(jù)測(cè)得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上直接查得未知蛋白質(zhì)樣品中得蛋白質(zhì)濃度。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)各種蛋白質(zhì)呈色基本相同;特異性和準(zhǔn)確度好,精密度好;呈色穩(wěn)定性好,試劑單一,方法簡(jiǎn)便?？焖?，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋

5、白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過(guò)查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過(guò)校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的pH相一致。酚試劑法此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以

6、增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。?Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高,比雙縮脲法靈敏約100倍。操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)也不是嚴(yán)格的直線(xiàn)形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、T

7、ris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線(xiàn)。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以

8、便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生?？捡R斯亮藍(lán)法考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白