蛋白質(zhì)含量測定方法比較

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1、[分享]蛋白質(zhì)含量測定方法比較蛋白質(zhì),含量,測定蛋白質(zhì)含量測定方法比較本實驗的目的是學(xué)會各種蛋白質(zhì)含量的測定方法。了解各種測定方法的基本原理和優(yōu)缺點。蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往

2、往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費的時間。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸

3、汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：CH2COOH

4、+3H2SO4®2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4®(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH®2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總

5、氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。五種蛋白質(zhì)測定方法比較如下：方法靈敏度時間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法（Kjedahl法）靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為±2％費時8～10小時將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測定；干擾少；費時太長雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低1～20mg中速20~30分鐘多肽鍵＋堿性Cu2＋®紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏

6、50～100mg快速5～10分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin－酚試劑法（Lowry法）靈敏度高～5mg慢速40～60分鐘雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時間長；操作要嚴(yán)格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)靈敏度最高1～5mg快速5～15分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm強(qiáng)堿性緩沖液；TritonX-100;SDS最好的方法；干擾物質(zhì)

7、少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化二、雙縮脲法（Biuret法）（一）實驗原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。H2OO=CC=OHNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色絡(luò)合物紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)

8、。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材1.試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配

9、制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。（2）雙縮脲試劑：稱以1.50