western blot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

《western blot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、western?blot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)1我做了很久的WB，最大的一個難點(diǎn)感覺在于樣品制備上！蛋白的降解有些時候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事~~如果單獨(dú)做WB的話，感覺以“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強(qiáng)的裂解液，甚至直接給loadingbuffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbuffer100度充分變性，再分裝保存。有些時候比蛋白酶抑制劑更有效。另一個感覺就是樣品中目的蛋白的量，限于WB的檢測下限問題，一般目的蛋白量最好別低于1ng（雖然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上為好。這就要求

2、在做WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能豐度，最好充分的準(zhǔn)備工作然后再設(shè)計(jì)細(xì)胞量或者組織量，千萬別把樣品搞稀了，否則就不好辦了。最后，還是多看文獻(xiàn)，在做某個蛋白之前最好看看別人是如何做的，有什么特殊要求，內(nèi)參如何選等等。western?blot失敗經(jīng)驗(yàn)總結(jié)2我就跑膠和轉(zhuǎn)膜談一點(diǎn)兒自己的體會1、跑膠電泳Buffer重復(fù)利用的時候要注意，不能混濁，有時候能用個3－4次，有時候第二次都不行了，事先前預(yù)電泳一下，看看氣泡的均勻度；Buffer一定要淹過梳子孔，否則就會發(fā)現(xiàn)今天的蛋白不會跑；跑的時候先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑條帶會分離的更好，特別是對

3、于高分子量的目的蛋白；2、轉(zhuǎn)膜我用的是濕轉(zhuǎn)，Buffer一定要預(yù)冷，最好提前一天配好放4度；濾紙不要大過PVDF膜，防止短路；膠在負(fù)極，膜靠近正極，放入Tank前檢查一遍會使你免以體會放反的痛心疾首；膜要標(biāo)記好正反面；轉(zhuǎn)膜過程中，經(jīng)常過去看看，防止意外，如電泳儀接觸不好。ＷＥＳＴＥＲＮ?ＢＬＯＴＴＩＮＧ心得１．??總蛋白提?。ò?，胞漿，胞核）：組織勻漿后,15000g,4度,20分鐘后,取上清.Buffer:NP40750ul,脫氧膽酸鈉0.5克,SDS0.1克,加1*PBS至100ml.再加入PMSF(7.4mg/ml)0.1ml.(現(xiàn)用現(xiàn)加)7.4mg/mlPMSP異

4、丙醇溶液:取AmgPMSF加A/7.4ml異丙醇.工廠-20度儲存２．組織膜蛋白提?。核诓僮鞅线M(jìn)行（1）取組織，用PBS沖洗干凈組織上的血液.加入10mlBufferA,用剪刀盡可能剪碎組織,于冰上充分勻漿。每次30秒,重復(fù)3-5次.（2）離心機(jī)1000rpm，4℃離心10min后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。(去掉大塊組織及結(jié)締組織)（3）100000g，4℃離心1hr,棄去上清.(此為胞漿蛋白,若只提取胞漿蛋白,可用10000rpm,4度,30分鐘離心，取上清即可)。沉淀用適量的BufferB重懸，4度過夜后，分裝至EP管，Eppendorf臺式離心機(jī)10000rpm

5、，4℃離心30min。（4）收集所得上清液即為膜組份。BufferA：0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預(yù)冷。BufferB20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEGTA,0.2mM，PMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預(yù)冷。所得蛋白分裝EP管（每管約5

6、0ul），取一管測蛋白濃度，其它放入-70度深凍冰箱保存。如果要定量的話，最好能立即根據(jù)濃度，加入上樣緩沖，煮沸，4度保存。反復(fù)凍融蛋白會降解，濃度不準(zhǔn)?？捡R斯亮蘭Ｇ２５０測蛋白濃度：考馬斯亮蘭Ｇ２５０配方：G2500.4克,95%乙醇100ml,85%磷酸200ml,加水至2000ml,過濾后使用。BSA標(biāo)準(zhǔn)液：0.5mg/mlBSA,雙蒸水配制。配制標(biāo)準(zhǔn)液(濃度分別為0，10，20，30，40，50ug/ul)：??1??2??3??4??53??6G250??3ml??3ml??3ml??3ml??3ml??3ml0.5mg/mlBSA??------??20ul??

7、40ul??60ul??80ul??100ulddH2O??100ul??80ul??60ul??40ul??20ul??-----待測蛋白配液：每管3mlG250，2ul樣品，98ulddH2O。（若加入樣品后，液體沒有變藍(lán)色，則可再加2ul樣品，ddH2O減為96ul，標(biāo)準(zhǔn)液濃度可適當(dāng)擴(kuò)大。）紫外分光光度計(jì)，595nm，用1號管調(diào)零，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程及R值（R值應(yīng)大于0.99,否則操作誤差較大）,測量待測蛋白OD值，算出蛋白濃度。（若加入2ul樣品，則濃度值需除2，方為真正濃度；若加4ul樣品，則除4）聚