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《羥基磷灰石和殼聚糖制備微米級微球支架》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、羥基磷灰石和殼聚糖制備微米級微球支架 運用組織工程骨進行骨組織再生修復已成為當下研究的熱點之一。而生物支架在骨缺損的修復過程中起到關鍵性作用，被譽為組織工程的基石.復合類仿生支架（有機物與無機物結(jié)合）可以模擬天然成熟骨組織的結(jié)構，在促進干細胞增殖、骨向分化等方面具有顯著優(yōu)勢[1].羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAp）作為人體骨骼和牙齒的主要組成，生物相容性良好，并有足夠的機械強度可承受體內(nèi)壓力；納米級HAp利于成骨細胞黏附，具有骨誘導性，常被作為仿生支架的制備原料[2].殼聚糖（chito
2、san,CS）作為一種天然的再生聚合物，生物性能佳，易于化學改性并對體內(nèi)大分子有高度親和性，是一類頗有前景的組織工程支架材料[3].該研究采用微流體技術將納米HAp和CS制備成微米級微球支架，并通過一系列細胞學實驗評估其作為組織工程支架的生物學作用?！ ?材料與方法 1.1材料及設備 1.1.1實驗動物與試劑SPF級雄性4周齡SD大鼠20只，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。微球制備相關試劑（國藥集團化學試劑有限公司）,高糖型DMEM（美國Invitrogen公司）,胎牛血清（FBS）（中國四季青公司）
3、,異硫氰酸標記的鬼筆環(huán)肽（FITC-Phalloidin）、DAPI（美國Sigma公司）,瓊脂糖（美國Solarbio公司）. 1.1.2主要儀器微量進樣泵（中國蘭格恒流泵有限公司）,pH計（PHS-3B,中國上海虹益公司）,Countstar自動細胞計數(shù)儀（IC1000,中國上海睿鈺生物科技有限公司）,熒光倒置顯微鏡（DMI3000B,德國Leica公司）,場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM-6700F,日本JEOL電子公司）,共聚焦掃描式顯微鏡（SP5-DMI6000-DIC,德國Leica公司）.
4、1.2方法 1.2.1HAp納米顆粒合成5mmol尿素溶于20ml乙醇與水（3∶1）混合溶液中，加入CaCl2（0.1mol/L,8.35ml）與NaH2PO4（0.1mol/L,5ml）,pH值調(diào)至11.9.攪拌30min,置于80℃烘箱24h.產(chǎn)物洗滌凍干備用?！ ?.2.2復合微球制備及顯微鏡下形態(tài)學觀察CS及HAp各40mg加入19.6ml蒸餾水中，超聲破碎20min,所得HAp-CS混合溶液作為內(nèi)相，環(huán)己烷溶液（含3%司班80）作為擠出相。利用微量進樣泵控制兩相擠出速度，外向1ml/min,內(nèi)
5、相0.05ml/min,進行微球制備，NaOH乙醇溶液（0.4mol/L）進行收集固化，所得HAp-CS復合微球蒸餾水反復清洗，顯微鏡下觀察微球形態(tài)。 1.2.4細胞黏附率及增殖率微球高溫高壓滅菌了，與P2代骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemarroesen-chymalstemcells,BMSCs）體外共培養(yǎng)。黏附率：細胞與微球復合之比為50∶1（細胞初始濃度為C0=5104/ml）.設置3個復管，置于培養(yǎng)搖床上，先動態(tài)培養(yǎng)5min,后靜置30min,交替進行6h.1、2、3、4、5、6h等6個時間點，分
6、別吸取1ml細胞微球混合溶液，靜置1min,上清液中的游離細胞計數(shù)為Ct,黏附率為（C0-Ct）/C0100%.取3個復管平均值。增殖率：前6h動靜態(tài)交替培養(yǎng)操作同上，設置3個復管。1、3、6、9d時，取1ml細胞微球混懸液，靜置后吸除上清液，PBS清洗3次，胰酶消化，定容至1ml,細胞和微球均計數(shù)，細胞濃度為C,每毫升微球數(shù)為N,二者之比為C/N,該數(shù)值隨時間的增長體現(xiàn)了細胞在微球上的增殖。3個復管所得值求平均數(shù)。共2頁:12 1.2.5掃描電鏡觀察BMSCs與微球支架的復合狀態(tài)細胞材料復合1、3、6
7、、9d后，每種材料各取1ml細胞材料混懸液，PBS清洗3次，2.5%戊二醛室溫固定30min,冷凍干燥后進行掃描電鏡觀察?！ ?.2.6細胞骨架染色及共聚焦掃描式顯微鏡觀察細胞材料復合后6d,取1ml細胞材料混懸液，PBS輕緩清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20min,PBS清洗（5min3）.FITC-Phalloidin（5μg/ml）避光染色40min.PBS清洗10min,清洗3次。DAPI（1μg/ml）避光染5min.PBS洗3次。共聚焦掃描式顯微鏡觀察?！ ?.2.7體外模具實驗6
8、cm培養(yǎng)皿中加入5ml高溫高壓滅菌的2%瓊脂糖后，其厚度為2mm.待其凝固后，使用直徑為5mm的打孔器，瓊脂糖上便形成直徑為5mm、厚度為2mm的圓形缺損，與標準骨缺損尺寸吻合。將細胞和微球共培養(yǎng)1d后填充至上述模具中，表面蓋篩X，加入5ml培養(yǎng)液，每2~3d換一次液，培養(yǎng)14~21d,觀察組織塊形成情況?！ ?結(jié)果 2.1顯微鏡下微球形態(tài)觀察將所制備的HAp-CS復合微球分散在水中，顯微鏡下可見其表面光滑，粒徑均勻，大小為
