資源描述：
《三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系hepg》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG：朱傳升 侯明 王金慎 王焱 徐文偉 董琳【摘要】 目的：測定不同濃度三氧化二砷（As2O3）誘導(dǎo)前后HepG-2細(xì)胞自噬水平改變，并初步探討機(jī)制。方法：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，按As2O3不同濃度分組；采用MDC染色，熒光顯微鏡觀察自噬囊泡，流式細(xì)胞術(shù)檢測其熒光強(qiáng)度；RT-PCR檢測Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄，免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞Bcl-2蛋白陽性百分率，并分析同自噬的關(guān)系。結(jié)果：經(jīng)不同濃度As2O3作用后，HepG-2細(xì)胞生長明顯受到抑制；熒光顯微鏡可觀察到自噬囊泡的出現(xiàn)；Bcl-2基因表達(dá)降低
2、；經(jīng)相關(guān)性分析，HL-60細(xì)胞自噬水平與Bcl-2基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論：As2O3可誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬，v誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬的機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)，自噬和凋亡存在交叉。【關(guān)鍵詞】自噬 基因，Bcl-2 三氧化二砷 肝腫瘤 細(xì)胞 培養(yǎng)的 StudyofHepG-2cells’autophagyinducedbyarsenictrioxideanditsmechanism【ABSTRACT】Objective:Toassessthelevelofautophagyanditsmechan
3、isminHepG-2cellsafterinductionicroscopeandfloetrybymonodansylcadaverin（MDC）staining.RT-PCRinetheBcl-2mRNAexpression.APAAPicroscope;Bcl-2geneexpressionayinduceHpG-2cellstoautophagiaanditsmainmechanisms·Cells,cultured 三氧化二砷（As2O3）作為一種抗腫瘤藥物，主要機(jī)制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。關(guān)于As2O3
4、是否可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生非凋亡形式的死亡（如自噬等），國內(nèi)外報(bào)道較少。本研究通過觀察不同濃度As2O3作用HepG-2細(xì)胞前后自噬水平的變化，初步探討了其發(fā)生機(jī)制，總結(jié)報(bào)道如下。1 材料與方法1.1 主要試劑 單丹磺酰尸胺（MDC，貨號30432）為美國sigma公司產(chǎn)品，臨用前用PBS配制成0.05mmol/L；As2O31g/L（哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)產(chǎn)品），用前RPMI1640稀釋成所需濃度；RT-PCR所用TapDNA聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制劑等購自上海志壯生物有限公司；目的引物參照文獻(xiàn)說明，由上海生工合成。
5、免疫組化試劑盒、鼠抗人Bcl-2單抗、羊抗小鼠lgG二抗均購自北京中杉金橋生物有限公司。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 肝癌細(xì)胞株HepG-2由山東省千佛山醫(yī)院普外科中心實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以2×105ml-1接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為10%胎牛血清的RPMI1640，置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱，行細(xì)胞爬片生長。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度As2O3處理。按As2O3濃度不同分為0（對照組）、1.0、2.0、4.0和8.0μmol/L5組；各組于處理24h后用0.25%胰蛋白酶消化，收獲細(xì)胞或取出細(xì)胞爬片，進(jìn)
6、行觀察研究。1.3 一般形態(tài)觀察 分別于加藥前后倒置顯微鏡觀察，并攝片。1.4 MDC熒光染色檢測自噬自噬泡（autophagicvacuoles，AV）的染色：參考文獻(xiàn)[1]，取出細(xì)胞爬片，PBS洗2次，除去含血清的培養(yǎng)基。用0.05mmol／LMDC于37℃溫育60min后，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗2次，晾干后，使用熒光顯微鏡（Olympus）加356nm發(fā)射濾片和545nm斷濾片進(jìn)行觀察和攝片。1.5 自噬的流式細(xì)胞術(shù)定量分析 以上述MDC染色方法染色，用Elite流式細(xì)胞儀（COULTER公司，
7、USA）以488nm激發(fā)波長，測定MDC染色的熒光強(qiáng)度。將光散射及熒光數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)分析得出結(jié)果。1.6 RT-PCR檢測Bcl-2mRNA表達(dá) 37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，PBS洗2次。采用異硫氰酸胍一步法提取RNA，260/280nm測定其濃度和純度；RT-PCR步驟參照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明。Bcl-2引物序列:Sense5’￣TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG￣3’，Antisense5’￣TCACTTGTGGCTCAGATAGG￣3’，片段280bp；β￣action引物序
8、列：Sense5’￣GGGTCAGAAGGATTCCTGTG￣3’，Antisense5’￣GGTCTCAAACATGATCTGGG￣3’，片段317bp。PCR產(chǎn)物各20μl,在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色,并在紫外燈下顯影拍照。1.7 免疫組化法檢測細(xì)胞Bcl-2蛋白陽性率 采用APAAP法，具體染色步驟參照試劑盒說明。陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出
