三氧化二砷誘導(dǎo)hep

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1、三氧化二砷誘導(dǎo)Hep【關(guān)鍵詞】As2O3細(xì)胞周期凋亡Hep-2細(xì)胞近年研究結(jié)果證實(shí)，腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖周期有關(guān)，且與凋亡亦有特殊的生物學(xué)意義［1］。因此，探討細(xì)胞凋亡機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的凋亡誘導(dǎo)劑具有理論和實(shí)際意義，As2O3是中藥砒霜的主要有效成分，作為藥用已有2400多年的歷史，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)可有效治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)其他惡性腫瘤也有作用［2］。本研究以Hep-2細(xì)胞為靶系統(tǒng)，體外探討As2O3對(duì)細(xì)胞周期變化及其誘導(dǎo)凋亡作用，以期為抗喉癌藥物的篩選提供依據(jù)。1材料

2、與方法1.1材料（1）As2O3為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，以磷酸鹽緩沖液配制成50μmol/L儲(chǔ)存液，-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?）Hep-2細(xì)胞（人喉癌細(xì)胞株）由吉林省腫瘤研究所提供。（3）RPMI1640培養(yǎng)基，MTT試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1MTT比色法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為2×106/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔100μl，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合時(shí)，每孔內(nèi)分別加入不同濃度的As2O3溶液，0μmol/L、1μmo

3、l/L、3μmol/L、5μmol/L，每個(gè)濃度6復(fù)孔，靜止培養(yǎng)24h，于結(jié)束前6h加入MTT試劑20μl/孔，終濃度為500mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6h加入酸化異丙醇50μl/孔，振蕩5min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用酶標(biāo)儀于550nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算Hep-2細(xì)胞增殖抑制率。Hep-2細(xì)胞抑制率=（1-加藥孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值）×100%，結(jié)果見表1。1.2.2流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)及分組同MTT比色法，不同之處為將96孔培養(yǎng)板改為50ml培養(yǎng)瓶進(jìn)行，培養(yǎng)結(jié)束后用0.25%胰蛋白酶消

4、化收集細(xì)胞，PBS洗二次，70%冷乙醇固定，上機(jī)前過4S目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，上機(jī)分析細(xì)胞周期的改變及細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見表2。1.2.3透射電鏡觀察Hep-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞分組及培養(yǎng)條件同MTT比色法，收集經(jīng)不同濃度As2O3作用的Hep-2細(xì)胞，離心棄上清，將沉淀于管底的Hep-2細(xì)胞用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電鏡觀察，拍照，結(jié)果見圖1，2。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法隨機(jī)分組，組間比較用F檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。表1不同濃

5、度As2O3對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖抑制率圖13μmol/LAs2O3對(duì)Hep-2亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞空化，線粒體腫脹（×5000）圖25μmol/LAs2O3對(duì)Hep-2亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞核破碎，可見凋亡小體（×5000）3討論近年來，有關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制及其與惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究進(jìn)展較快，研究結(jié)果表明，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，作用靶點(diǎn)各異的抗腫瘤藥物，既可以阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，又可以誘導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的重要標(biāo)志［3］。本研究應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)As2O3對(duì)Hep-2細(xì)

6、胞的增殖抑制率，收到了滿意的效果，結(jié)果顯示，As2O3對(duì)Hep-2細(xì)胞抑制率呈劑量依賴性，抑制率為29%～52%，因?yàn)镸TT試劑可被哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成藍(lán)色甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活化狀態(tài)呈線性關(guān)系，該法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活的客觀指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，不同濃度的As2O3對(duì)Hep-2細(xì)胞周期均有影響，與對(duì)照組相比差異均顯著，但在組間比較時(shí)，3μmol/L與5μmol/L差異不顯著，但是在量上還是有區(qū)別的。As2O3可使Hep-2細(xì)胞G0

7、/G1細(xì)胞阻滯，G0/G1期細(xì)胞增多，影響G1期細(xì)胞向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)程，致使S期細(xì)胞減少，而G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，在真核細(xì)胞周期演進(jìn)過程中存在一關(guān)鍵過渡點(diǎn)［4］，當(dāng)其受到外界壓力時(shí)會(huì)限制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，被稱為細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，主要有G0/G1期檢測(cè)點(diǎn)，S期檢測(cè)點(diǎn)和G2/M期檢測(cè)點(diǎn)，我們的結(jié)果顯示，As2O3對(duì)Hep-2細(xì)胞G1期阻滯，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M相對(duì)增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普通反應(yīng)，這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上反映更為明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［5］，藥物作用后，細(xì)胞首先通過S期緩慢，

8、繼之阻滯于G2/M期，高濃度時(shí)細(xì)胞死亡，而死亡的形式是以凋亡為主。因此，本研究證明As2O3為細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用G1期。此外，本研究還應(yīng)用電子顯微鏡觀察As2O3作用的Hep-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞高度空化，線粒體腫脹，染色質(zhì)趨邊凝集，可見到凋亡小體改變。本實(shí)驗(yàn)通過多種方法證明As2O3對(duì)Hep-2細(xì)胞系有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，具有劑量依賴性，為As2O3臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)