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1、略論抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55【,轉(zhuǎn)基因；番木瓜55-1； ?。耗康慕?duì)抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1進(jìn)行品系鑒定的檢測(cè)方法。方法采用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法及試劑盒方法進(jìn)行番木瓜基因組DNA提取，根據(jù)番木瓜管家Papain基因和抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1品系的外源結(jié)構(gòu)基因(35S-GUS)和調(diào)控基因(NOS-35S)序列設(shè)計(jì)合成特異性檢測(cè)引物，采用PCR技術(shù)對(duì)抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1進(jìn)行品系鑒定。結(jié)果內(nèi)源Papain基因PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，改良CTAB法及試劑盒方法都可用于番木瓜種籽及果肉的DNA提取。實(shí)驗(yàn)中合成的引物及建立的PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)參數(shù)能
2、特異性地?cái)U(kuò)增轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1的外源基因35S-GUS序列和NOS-35S序列。該方法的盡對(duì)檢測(cè)低限為815×10-2ng，相對(duì)檢測(cè)低限為014％。結(jié)論本檢測(cè)方法有較高的穩(wěn)定性，能有效地對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1進(jìn)行品系鑒定，該方法的檢測(cè)靈敏度可完全滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)治理定性檢測(cè)的需要?！ 。恨D(zhuǎn)基因；番木瓜55-1； PCRPCRforevent-specificdetectionoftransgenicvirusresistantpapaya55-1 Abstract：ObjectivePCRassayethylAmmoniumBromide(CTAB)methodandQi
3、agenDNeasyplantminikitpapayaseedandfruit.SpecificprimersforPCRdetectionofpapaya55-1plifyendogenouspapaingenesequenceandexternalsegments,35S-GUSandNOS-35S,andcorrespondingdetectionmethodsplificationofpapaingeneindicatedthatboththedevelopedCTABmethodandQiagenDNeasyplantminikitpapayaseedandfruit
4、.Resultsofamplificationoftheexternalsegments(35S-GUSandNOS-35S)indicatedthatthedevelopedmethoditofdetection(LOD)ofthemethodgotto8.15×10-2ngand0.14%respectively.ConclusionThedevelopedPCRmethodcandetecttransgenicvirusresistantpapaya55-1speciallyanddetectivesensitivitycansatisfytheneedofqualitat
5、ivedetectionforgeicallymodifiedfoods. Keyodified;papaya55-1;PCR 番木瓜屬熱帶亞熱帶重要水果，為有效控制番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)對(duì)番木瓜產(chǎn)業(yè)的威脅，1998年世界上第1個(gè)轉(zhuǎn)基因番木瓜品系――抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1在美國(guó)和加拿大獲準(zhǔn)貿(mào)易種植〔1，2〕。從此轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1以其獨(dú)特的抗病上風(fēng)被廣泛種植，每年都有大量轉(zhuǎn)基因番木瓜流進(jìn)國(guó)際水果市場(chǎng)。本探究采用改良十六烷基-三甲基-溴化銨(CTAB）法及試劑盒方法進(jìn)行番木瓜基因組DNA提取，根據(jù)番木瓜管家Papain基因和抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1品系的外源
6、結(jié)構(gòu)基因(35S-GUS)和調(diào)控基因(NOS-35S)序列設(shè)計(jì)合成特異性檢測(cè)引物，采用PCR技術(shù)，建立對(duì)抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1進(jìn)行品系鑒定的檢驗(yàn)方法，為今后轉(zhuǎn)基因番木瓜的標(biāo)識(shí)治理及平安性評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持?！ ?材料和方法 11材料轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1種籽由香港政府化驗(yàn)所友情提供。市場(chǎng)抽檢番木瓜購(gòu)自深圳市翠竹萬(wàn)佳超市及深圳市田貝一路街邊水果店?！ ?2儀器和試劑MJRPTC-220擴(kuò)增儀，SynGeneGeneGenius凝膠成像系統(tǒng)，EppendorfBiophotometer核酸蛋白分析儀。植物DNA提取試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)；TaqDNA聚合酶、UNG酶(美
7、國(guó)Promega公司)?！ ?3DNA提取 131樣品前處理取番木瓜種籽，自然晾干后破碎至約05mm左右備用。番木瓜果肉直接破碎成泥，離心往水相后備用?！ ?32試劑盒DNA提取方法采用DNeasyPlantMiniKit試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，并按使用說(shuō)明操縱?！ ?33改良CTAB法取100mg處理好的樣品至2ml離心管中，加進(jìn)500μl2％CTAB裂解液，65℃水浴30min。加進(jìn)300μl氯仿／異戊醇(24：1)充分混合約5min，12000r／min，離心5m
