參考教案-蔗糖酶的提取純化與鑒定

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1、參考教案：酵母蔗糖酶的提取純化與鑒定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（卩一D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2-糖苻鍵裂解，釋放出等量的果糖和葡萄糖。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高，約為蔗糖1.36?1.60倍，在工業(yè)上具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?？捎靡赞D(zhuǎn)化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高濃度糖漿屮的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的軟心糖，還可為果葡糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的方法。蔗糖酶以阿種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)

2、和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞脫內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶，含宥少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個(gè)亞基比PJ酶多兩個(gè)氨基酸，Ser和Met,它們的分子量也不同，外酶約為27萬（或22萬，與酵母的來源有關(guān)），內(nèi)酶約為13.5萬。盡管這W種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分和似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取

3、純化的主要是外酶。每摩爾蔗糖水解產(chǎn)生兩摩爾還原糖，蔗糖的裂解速率可以通過NeLson法測定還原糖的產(chǎn)生數(shù)量來測定。一個(gè)酶活力單位規(guī)定為在標(biāo)準(zhǔn)分析條件下每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的數(shù)量。比活力單位為每毫克蛋白含有酶活力單位。（本實(shí)驗(yàn)以酵母為原料）一、教學(xué)0的通過酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)及蔗糖酶的提取純化與鑒定使學(xué)生學(xué)會(huì)生物大分子（酶）制備方案設(shè)計(jì)和幵展實(shí)踐研究的方法，體驗(yàn)從復(fù)雜細(xì)胞混合物體系中提取純化酶的基本原理、過程和方法。本實(shí)驗(yàn)為學(xué)生提供一個(gè)較全而的科學(xué)研究實(shí)踐機(jī)會(huì)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程學(xué)生獨(dú)立完成，里然操作難度較大，

4、所需要的實(shí)IX!較長（64學(xué)吋），但每一步單元操作的原理清晰，技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，能給學(xué)生較多的設(shè)計(jì)空間和動(dòng)手機(jī)會(huì)，有利于培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和從事科學(xué)研究的能力。二、教學(xué)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：包括講課，答疑，文獻(xiàn)綜述6學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)一酵母細(xì)胞破碎與蔗糖酶提取條件的選擇8學(xué)吋實(shí)驗(yàn)二蔗糖酶的鹽析曲線的制作與沉淀分離8學(xué)吋實(shí)驗(yàn)三蔗糖酶的有機(jī)溶劑沉淀曲線的制作與沉淀分離8學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)四蔗糖酶的DEAE-纖維素柱層析純化8學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)五鹿糖酶的SephadexG-150柱層析純化8學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)六蔗糖酶溶液的冷凍干燥2學(xué)吋實(shí)驗(yàn)七

5、蔗糖酶的純度分析：聚丙烯酰胺凝膠電泳8$時(shí)實(shí)驗(yàn)八蔗糖酶的理化性質(zhì)研究8學(xué)時(shí)三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與研究1器材與方法1.1主要單元操作技術(shù)與設(shè)備1.1.2單元操作技術(shù)細(xì)胞組織破碎術(shù)、離心分離技術(shù)、雙水相萃取技術(shù)、離子交換層析技術(shù)、凝膠層析技術(shù)、超濾技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)、分光光度技術(shù)、電泳技術(shù)等生物分離與檢測技術(shù)；1.1.2主要設(shè)備烘箱、恒溫?fù)u床、真空干燥箱、分析天平、電子臺(tái)秤、超聲波細(xì)胞破碎儀、粉碎機(jī)、超濾器(500ml?5000ml)、冷凍離心機(jī)(8000-10000r/min,50mlX6；250mlX6

6、),普通離心機(jī)(5000r/min,200mlX4)＞臺(tái)式離心機(jī)(16000r/min,5mlX6)冷凍T燥機(jī)、-80度冰箱、制冰機(jī)、酸度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、勻漿機(jī)、蛋白質(zhì)色譜分離系統(tǒng)(核酸蛋白檢測儀、部分收集器、嬌動(dòng)泉、梯度混合器、10-25mm,h300-700mm層析柱)電泳儀及垂直板電泳槽、脫色搖床、紫外-可見光分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、高效液相色譜、氣相色譜、凝膠成像系統(tǒng)、250ml和500ml旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、微景凱氏定氮儀、常景凱氏定氮儀、500-1000W電爐、超聲波清洗器、振動(dòng)混合

7、器、移夜槍（200-5000ul）、層析缸、電吹風(fēng)等。1.2.11.2實(shí)驗(yàn)材料與試劑5母菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：采用采用實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過篩選誘變獲得的酵母菌，增殖培養(yǎng)基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸鎂0.lg/L和磷酸二氫鉀0.lg/L,調(diào)節(jié)pH為5.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖12%?15%、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L,七水硫酸鎂0.lg/L,磷酸二氫鉀0.lg/L和硫酸銨0.5g/L,調(diào)節(jié)pH為5.0。1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑甲苯（使用前預(yù)冷到O'C以下）；95%乙醇

8、;DEAE-纖維素;SephadexG-150；0.05mol/LTris-HCl緩沖液，pH7.3；十二烷基硫酸鈉（SDS）;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2分析方法1.2.1蛋白質(zhì)濃度的測定：采用Folin法（試劑方法參考生物化學(xué)原理和方法）。1.2.2還原糖的測定：釆用DNS法（試劑方法參考生物化學(xué)原理和方法）。1.2.3酶活性測定（參考：徐樺，陸珊華，孫愛民.酵母蔗糖酶Km值的測定[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999,17(4):329-330)取適當(dāng)稀釋的酶液0.5mL,加入0.3mLpH