藻藍(lán)蛋白的提取純化與鑒定(實(shí)驗(yàn)教案)

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1、藻藍(lán)蛋白的提取純化與鑒定(實(shí)驗(yàn)教案)藻藍(lán)蛋白(phycocyanin,PC)是一種存在于藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的光合色素，能高效捕獲光能。其分子質(zhì)量在40ku左右，由a、0兩個(gè)亞基組成，亞基分子質(zhì)量都在20ku左右。肽鏈上共價(jià)結(jié)合1個(gè)開鏈的四毗咯環(huán)輔基,類似動(dòng)物紅細(xì)胞的血紅素結(jié)構(gòu)。天然存在的藻藍(lán)蛋白通常以六聚體(a3)6的形式存在。與之相近的別藻藍(lán)蛋6(AnthocyaninZAPC)為三聚體(aB)3,在650nm處有最大吸收峰。分離純化的水溶藻藍(lán)蛋白在溶液中呈藍(lán)色,并發(fā)岀紫色熒光，在波長620nm具有特異吸收峰，可用吸光度A

2、620/A280表示其純度。因其水溶性、無毒、清亮且著色力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，藻藍(lán)蛋白被廣泛用于食品著色劑和化妝甜的添加劑。藻藍(lán)蛋白帶有熒光，可用作熒光標(biāo)記物。一、教學(xué)目的通過藻藍(lán)蛋白的提取純化與鑒定使學(xué)生學(xué)會(huì)生物大分子制備方案設(shè)計(jì)與實(shí)踐研究，體驗(yàn)從復(fù)雜細(xì)胞混合物體系中提取生物大分子的基本原理、過程和方法。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程學(xué)生獨(dú)立完成，雖然操作難度較大，所需要的實(shí)間較長(64-80學(xué)時(shí))，但每一步單元操作的原理清晰，技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，能給學(xué)生較多的動(dòng)手機(jī)會(huì)。有利于培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。二、實(shí)驗(yàn)方案1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料鈍頂

3、螺旋藻粉產(chǎn)自中國科學(xué)院武漢植物所，其他無機(jī)鹽和酸堿試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?.2分析方法1.2.1藻藍(lán)蛋白濃度的測(cè)定方法一：【曲文娟等，鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋口的脈沖超聲輔助提取技術(shù)，食品科學(xué)，2007年5期,135-138】用紫外分光光度計(jì)對(duì)粗提的藻藍(lán)蛋白溶液進(jìn)行全波段掃描，可見藻藍(lán)蛋白的特征吸收在620nmz異藻藍(lán)蛋白的特征吸收在■力法二：【劉楊等，水提分離鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白及其穩(wěn)定性研究，天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，Vol.28No.3.11-14(2008)］螺旋藻中以藻膽蛋白吸收光譜的差異作為其測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。藻藍(lán)

4、蛋白(PC)在620nm處有最大光吸收，其含量測(cè)定參考王廣策等人的相關(guān)研究方法：cPC=0.1425A620(V)【王廣策，周百成，曾呈奎.鈍頂螺旋藻c■藻藍(lán)蛋白和多管藻R?藻紅蛋白的分離及其摩爾消光系數(shù)的測(cè)定［J］?海洋科學(xué)1996,20⑴：52255.】1.2.2藻藍(lán)蛋白的純度測(cè)定【劉楊等，水提分離鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白及其穩(wěn)定性研究，天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，Vol.28No.3.11-14(2008)1最大光吸收在650nm，式⑴-⑵PCAPC620和A650分別代表波長在620和650nm處的吸光度?！綤

5、aplanD,CalvertHE,PetersGA.TheazoIla?anabaenaazollaerelationship.XU:Nitrogenaseactivityandphycobiliproteinsoftheendophyteasafunctionofleafageandcelltype[J]?PlantPhysiol,1986,80(4):8842890.]1.2.3藻藍(lán)蛋白提取得率的計(jì)算【曲文娟等，鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白的脈沖超聲輔助提取技術(shù)，食品科學(xué)，2007年5期，135-138]藻藍(lán)蛋口提取得率(

6、T)為提取液屮藻藍(lán)蛋白的重量與原料重量的比值。按公式(2)計(jì)算：T=nV(A620-0.474A650)?100(3)5.34式中：n——樣品稀釋倍數(shù);V——提取液總體積,mL;G——原料質(zhì)量，mgo1.2.4總蛋口質(zhì)測(cè)定方法一：采用考馬斯亮藍(lán)法【李冰等，鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取純化新工藝，海洋科學(xué)，2007年，第31卷，第8期，48?52】取潔凈干燥的試管分成兩組按表1進(jìn)行操作。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為500mg/Lo以1-6號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度("L)為橫坐標(biāo),1-6號(hào)管A595nm值為縱坐標(biāo)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7、未知濃度的1：100倍稀釋后按照7■樣和&樣操作測(cè)定，根據(jù)A595值推算出濃度大小。1.3藻藍(lán)蛋白的提取分離1.3.1螺旋藻細(xì)胞的破碎和藻藍(lán)蛋白粗提液的制備螺旋藻細(xì)胞懸浮液：準(zhǔn)確稱取1.0?2.0g螺旋藻粉，加入200mL的pH二7.0、0.01mol/L的磷酸緩沖液,4°C分別浸泡24h備用。細(xì)胞破碎：(選擇凍融法或超聲波法)方法一(凍融法人収上述螺旋藻懸浮液在?20°C和30°C反復(fù)凍融(3次)使藻體細(xì)胞破碎,在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞破碎率在90%以上即可。方法二（超聲波法）：取上述螺旋藻懸浮液進(jìn)行超聲波破碎，破碎

8、條件：功率500W,能量80%,室溫，開3秒停2秒，破碎時(shí)間2-X分鐘（5分鐘），在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞破碎率在90%以上即可。離心分離:將破碎的螺旋藻細(xì)胞懸濁液于8000r/min離心15min?收集上清液可得到含藻蛋白的粗提液。在568、620和650nm處測(cè)粗提液的吸光度，計(jì)算藻藍(lán)蛋白的含量。1.3.2沉淀分離藻藍(lán)蛋白13.2.1鹽析法沉