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《傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞差異表達基因消減cdna文庫的構建.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞差異表達基因消減cDNA文庫的構建作者：張萍，山麗梅，肖小河，付強【關鍵詞】內(nèi)皮，血管/細胞學；抑制消減雜交；動脈硬化【Abstract】AIM：ToconstructasubtractedcDNAlibraryofdifferentiallyexpressedgenesinfreshlyisolatedadultbovineaorticendothelialcells(FiBEC)andculturednewbornaorticendothelialcells(CnBEC).METHODS：Thesuppressionsubtractiv
2、ehybridization(SSH)wasusedtoisolatecDNAfragmentsofnonexpressedorlowexpressedgenesinCnBEC.ThenthesecDNAfragmentsweredirectlyinsertedintoT/Acloningvestortosetupthesubtractivelibrary.Theamplifiedlibrarywasrandomlypickeda.ndidentifiedusingrestrictionenzymedigestion.RESULTS：Theamplifiedl
3、ibrarycontainedmorethan760bacterialclones.The64clonespickedrandomlyshowedthatallclonescontained200-600bpinsertsafterrestrictionenzymedigestion.CONCLUSION：Thelibrarylaysafoundationforscreeningandcloningthearteriosclerosisrelatedgenesinearlystage.[Keywords]endothelium；vascular/cytolog
4、y；suppressionsubtractivehybridization；arteriosclerosis【摘要】目的：構建傳代培養(yǎng)前后牛主動脈內(nèi)皮細胞差異表達基因的消減cDNA文庫，篩選動脈粥樣硬化相關新基因構建文庫.方法：采用抑制消減雜交技術，以新鮮分離和傳代培養(yǎng)的牛主動脈內(nèi)皮細胞作為對比材料，分離傳代培養(yǎng)主動脈內(nèi)皮細胞中不表迗或低表迗基因的cDNA片段，將其與T載體進行T/A連接構建文庫，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌進行文庫擴增后，隨機挑取64個白色克隆進行酶切鑒定.結果：擴增消減cDNA文庫獲得760個克隆，隨機挑取的64個陽性克隆經(jīng)酶切后均有200~60
5、0bp的插入片段.結論：構建的傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞差異表迗基因消減cDNA文庫，為進一步篩選早期發(fā)生改變的動脈粥樣硬化相關基因奠定了工作基礎.【關鍵詞】內(nèi)皮，血管/細胞學；抑制消減雜交；動脈硬化0引言動脈粥樣硬化是一種多因素損傷性疾病，許多基因在病變過程中均發(fā)生了改變，對發(fā)生變化的基因的深入認識將為探尋動脈粥樣硬化的發(fā)病機理及病變特征提供堅實的理論基礎.國內(nèi)外報道的動脈粥樣硬化相關基因多是oxLDL損傷前后培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞差異表迗的基因，所報道的許多基因的變化是與動脈粥樣硬化病變中發(fā)生改變的因子相吻和的［1］.但尚不具備病變組織特異性和病理損傷特異性.在血
6、管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)后和動脈粥樣硬化病變早期都發(fā)生G蛋白偶聯(lián)受體功能的明顯減弱或喪失［2-3］，從這一點上講血管內(nèi)皮細胞離體培養(yǎng)過程模擬了動脈粥樣硬化病變早期血管內(nèi)皮細胞發(fā)生的病理改變.本研究采用SSHR技術，構建新鮮分離的成牛主動脈內(nèi)皮細胞和傳代培養(yǎng)的新生牛主動脈內(nèi)皮細胞差異表達基因的消減cDNA文庫，為進一步篩選早期發(fā)生改變的動脈粥樣硬化相關基因奠定工作基礎.1材料和方法材料成牛主動脈（購自北京市大紅門清真食品廠）培養(yǎng)分離后獲得新鮮內(nèi)皮細胞；傳代（10代）培養(yǎng)的新生牛主動脈內(nèi)皮細胞（美國CnBEC公司）；大腸桿菌菌株TG1本室保存；載體pGEMT，磁珠分離mRN
7、A提取試劑盒；總RNA提取Trizol試劑，DMEM培養(yǎng)基干粉，胎牛血清，SuperScriptTMRNaseH活性缺失反轉錄酶；抑制削減雜交試劑盒；質(zhì)粒提取試劑盒,PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒；IPTG,Xgal,TaqDNA聚合酶；保真LATaq酶,DL2000核酸分子質(zhì)量標準.方法牛主動脈內(nèi)皮細胞總RNA及mRNA分離提取參照Trizol試劑說明進行RNA提取；參照Z5300磁珠分離mRNA試劑盒操作說明進行mRNA分離提取.抑制消減雜交參照文獻［4］及SSH試劑盒說明以FiBECcDNA為檢測子，以CnBECcDNA為驅(qū)趕子.①雙連cDNA的合成：取Test
8、er和DrivermRNA各2pg分別
