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《草魚腸道組織消減cdna文庫的構(gòu)建與免疫相關(guān)基因的克隆和表達(dá)分析》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、湖南農(nóng)業(yè)太幸博士擘值論丈草魚腸道組織消減cDNA文庫的構(gòu)建及免疫榍關(guān)難W的克降’，表達(dá)分析中文摘要草魚腸道組織消減cDNA文庫的構(gòu)建及免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析魚類生活在一個水體環(huán)境，其大面積的黏膜是病原感染魚類時最先接觸的部位，它們產(chǎn)生的黏膜免疫反應(yīng)是魚類參與免疫應(yīng)答過程的一個重要組成部分。本研究通過人工灌注嗜水氣單胞菌，采用抑制性消減雜交(SSH)的方法構(gòu)建了草魚腸道組織差異表達(dá)消減cDNA文庫，并對cDNA文庫克隆進(jìn)行了部分測序，測序結(jié)果進(jìn)行了同源性搜索和功能的分類。同時，對參與腸道組織免疫相關(guān)因子組織相容性復(fù)合物(MHC—11
2、Ⅱ)、Alpha-I．微球蛋白／bulinin前體蛋白基因的cDNA全長進(jìn)行克隆、序列分析，探討了它們在草魚不同組織中的表達(dá)分布。這些階段性研究為進(jìn)一步研究、闡釋魚類黏膜免疫機(jī)制積累了重要材料。本文的研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個方面：1．消減eDNA文庫構(gòu)建及其序列分析采用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了草魚腸道組織在細(xì)菌誘導(dǎo)條件下和未誘導(dǎo)條件下，兩個不同生理狀態(tài)的消減cDNA文庫，隨機(jī)挑取211個cDNA克隆進(jìn)行了單向測序，共獲得有效cDNA序列147個。序列同源性搜索結(jié)果顯示，在147個有效cDNA序列中，有97個克隆與GcnBank中
3、的已知功能序列具有較高的同源性，其中包含28條MHC類EST序列；17個與未知功能的序列有一定的同源性；33個序列在Blast搜索中沒有找到任何對應(yīng)的相似序列，可能是沒有鑒定的EST。97個已知功能的EST分別屬于46個不同的基因。根據(jù)Adams對功能基因的分類方法，所獲得EST分為8類，蛋白質(zhì)與基因表達(dá)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動、代謝、細(xì)胞防御、細(xì)胞分裂和其它未知功能的蛋自，在本實(shí)驗(yàn)獲得的EST分類，細(xì)胞防御類cDNA序列所占比例最高，為序列總數(shù)的27．2％，其次為信號傳導(dǎo)和代謝，分別為12．9％、12．2％，蛋白質(zhì)與基因表達(dá)為11．
4、6％。細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動、細(xì)胞分裂兩者所占比例相對偏低，說明在外源刺激的條件下，腸道組織細(xì)胞的防御、信號傳導(dǎo)、代謝、蛋白質(zhì)與基因表達(dá)相關(guān)因子都有一定的表達(dá)上調(diào)，特別是與防御相關(guān)因子。湖南農(nóng)業(yè)走學(xué)博士擘位論丈學(xué)魚腸道組織消減eDNA空庫的構(gòu)建及免疫相關(guān)皋州的免隆’j表達(dá)分析2．草魚腸道免疫相關(guān)基因MHC．II旺的eDNA的克隆及序列分析根據(jù)草魚消減文庫獲得的EST序列(GenBankAceNo：EW688194)設(shè)計(jì)特異性引物，分別用5'-RACE和3'-RACE的方法獲得MHC—lIot基因的全長eDNA序列(GenBankAecNo：EU
5、l86148)。采用生物信息學(xué)分析了MHC．IIⅡ基因cDNA序列的結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)，結(jié)果表明，所獲得的MHC．IIa基因eDNA全長為1007bp，開放閱讀框長度為717bp．可編碼238個氨基酸；5’菲翻譯區(qū)34bp，3’非翻譯區(qū)256bp；在nt962—967有一個AATAAA加尾信號。由MHC—IIct基因eDNA推斷的氨基酸序列編碼蛋白的等電點(diǎn)為4．92，分子量為26．4KDa。在序列的前部分存在一個由20個氨基酸組成的信號肽，在第210．232位存在一個跨膜區(qū)。氨基酸序列比較結(jié)果，草魚MHC．IIn氨基酸序列與鯉魚MHC—IIa
6、相似性最高，其次為斑馬魚，與比較的序列中的護(hù)士鯊相似性最低。系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析研究表明，草魚與鯉魚、斑馬魚進(jìn)化親緣關(guān)系最近，與護(hù)士鯊、非洲鯛親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。RT-PCR半定量分析組織中的表達(dá)分布，誘導(dǎo)后結(jié)果顯示，MHC．IIa在脾臟、頭腎、后腸有較高的表達(dá)，在肝臟表達(dá)較低，在肌肉中幾乎不表達(dá)。3．草魚腸道組織免疫相關(guān)基因Alpha-l-microglobullingprecursor,AMBP全長eDNA克隆與序列分析根據(jù)草魚消減eDNA文庫獲得的EST序列(GenbankAceNo：Ew688152)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物，采用5’RACE
7、和3’RACE方法，經(jīng)拼接獲得AMBP基因全長eDNA序列(GenbankAecNo：EUl86151)。AMBP基因eDNA全長序列為1230bp。開放閱讀框?yàn)?047bp，可編碼349個氨基酸。eDNA序列組成上，在3’端存在2個不穩(wěn)定的信號ATTFA和一個加尾信號AATAAA。生物信息學(xué)方法對AMBP基因eDNA分析表明，AMBP編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6．27，分子量為38．84KDa。在AMBP中存在一個由18個氨基酸組成的信號肽，但沒有預(yù)測到跨膜區(qū)域。經(jīng)Swiss．Model預(yù)測發(fā)現(xiàn)AMBP的空間結(jié)構(gòu)由兩個不同的結(jié)構(gòu)域組成，一個
8、屬于lipocalin家族蛋白的伽1．微球蛋白，一個為胰蛋白酶抑制卉時(Bikunin)。經(jīng)ClustalW同源性序列比較發(fā)現(xiàn)，AMBP氨基酸序列在相近物種中具有較高的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹明顯分為二大支，草魚
