連作地黃cdna消減文庫(kù)的構(gòu)建及其響應(yīng)基因的篩選

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1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文連作地黃cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建及其響應(yīng)基因的篩選姓名：范華敏申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：作物栽培學(xué)與耕作學(xué)指導(dǎo)教師：張重義；陳新建201205河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文捅要地黃為我國(guó)著名的常用大宗藥材，因具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老及降血糖等多方面功效，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域，年需求量越來(lái)越大。然而，地黃生產(chǎn)上存在嚴(yán)重的連作障礙問(wèn)題，每茬收獲后須隔跏10年方可再種，這嚴(yán)重制約著地黃的可持續(xù)發(fā)展，因此，緩解和消除地黃連作障礙效應(yīng)成為了亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。前人雖然對(duì)地黃連作障礙問(wèn)題進(jìn)行了廣泛的研究，但由于其形成及發(fā)生的原因錯(cuò)綜復(fù)雜，人們對(duì)引起地黃連作障礙效應(yīng)的分子機(jī)制

2、尚未深入研究。為了更深入的研究地黃連作障礙效應(yīng)的機(jī)制及其消減技術(shù)，本試驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以“溫85．5”地黃品種為供試材料，首次構(gòu)建了連作地黃eDNA消減文庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選了一些差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異基因時(shí)空表進(jìn)行了研究和初步的功能分析。主要研究結(jié)果如下：1．地黃cDNA消減文庫(kù)的構(gòu)建：分別提取正茬和重茬地黃的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈及雙鏈cDNA，充分酶切消化，分別獲得DrivereDNA和TestereDNA，并分別與2種不同的接頭連接，再進(jìn)行2次消減雜交和2次抑制性PCR擴(kuò)增，將第2次PCR產(chǎn)物純化后與pMD18．T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行文

3、庫(kù)擴(kuò)增，文庫(kù)擴(kuò)增后各得到近1000個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，并保存插入片段長(zhǎng)度分布在250---750bp之間的陽(yáng)性克隆的菌液。最終構(gòu)建得到了具有高消減效率的正、反向eDNA文庫(kù)。2．測(cè)序結(jié)果與生物信息學(xué)分析：隨機(jī)挑選正庫(kù)和反庫(kù)各300個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)BLAST進(jìn)行序列間比對(duì)，正庫(kù)獲得241條unique序列，反庫(kù)獲得223條unique序列，兩庫(kù)間重復(fù)序列為9條。分析后正庫(kù)、反庫(kù)分別獲得232條、214條差異的EST序列。將得到的序列與NCBI中的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分析。正庫(kù)、反庫(kù)中分別有200條、195條EST序列的基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)有功能注釋。蛋白質(zhì)直系同源簇(COG)數(shù)據(jù)

4、庫(kù)進(jìn)行比較，預(yù)測(cè)可能的功能。把通過(guò)比對(duì)獲得有功能描述基因(包括功能確定的及推測(cè)功能的)分類，正庫(kù)中有16類，反庫(kù)中有15類，主要是以下基因：能量的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換相關(guān)基因，氨基酸的運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因，核苷酸的運(yùn)輸和代謝，糖類(碳水化合物)的運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因，輔酶的運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因，脂質(zhì)化合物的運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成相關(guān)基因，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因，復(fù)制、重組、修復(fù)，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物合成相關(guān)基因，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶相關(guān)基因，無(wú)機(jī)離子的運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相關(guān)基因，核結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架相關(guān)基因，一般功能的預(yù)測(cè)相關(guān)基因和一些功能未知相關(guān)基因，3．相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)與

5、顯著性分析：分別對(duì)正庫(kù)中篩選的5個(gè)基因(分別編碼鈣依賴性蛋白激酶、SAM合成酶、ACC氧酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、鈣蛋白酶)和反庫(kù)中篩選的5個(gè)基因(分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶、RNA復(fù)制酶、依賴于DNA的RNA聚合酶IIa、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)胞周期蛋白D、RNA結(jié)合蛋白)在地黃各個(gè)時(shí)期各個(gè)組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：反庫(kù)中的5個(gè)基因在重茬地黃中有較高的表達(dá)量，在正茬地黃中幾乎無(wú)表達(dá)，每個(gè)時(shí)期幾乎都達(dá)到了顯著差異水平，且在塊根膨大期達(dá)到極顯著差異水平；而正庫(kù)中的5個(gè)基因在正茬地黃中均有較高表達(dá)，而在重茬中表達(dá)量下降或無(wú)表達(dá)，各時(shí)期各部位的表達(dá)量也均達(dá)顯著性差異水平，并在塊根伸長(zhǎng)期與膨

6、大期達(dá)極顯著差異水平。這一結(jié)果一方面驗(yàn)證了我們前期構(gòu)建的正、反差異表達(dá)cDNA文庫(kù)的正確性，同時(shí)也初步顯示了10個(gè)基因在地黃連作障礙形成中可能發(fā)揮一定的功能。4．基因的相關(guān)功能分析：正庫(kù)中鈣依賴性蛋白激酶、鈣蛋白酶主要參與鈣信號(hào)傳遞和蛋白質(zhì)分解，SAM合成酶和ACC氧化酶主要參與乙烯的合成，甲基轉(zhuǎn)移酶主要參與生理調(diào)控和染色質(zhì)修，這5個(gè)基因在重茬地黃中均顯著上調(diào)了。反庫(kù)中RNA復(fù)制酶、RNA聚合酶、依賴于DNA的RNA聚合酶Ⅱa這三種酶主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和植物抗病毒作用，細(xì)胞周期蛋白D主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂，而RNA結(jié)合蛋白主要參與基因的表達(dá)調(diào)控和抗逆反應(yīng)，而這5個(gè)基因在重茬地黃中均被下調(diào)或關(guān)閉了

7、。本試驗(yàn)結(jié)合消減雜交技術(shù)和定量PCR技術(shù)，首次構(gòu)建了地黃消減文庫(kù)，初步揭示了響應(yīng)連作地黃基因的表達(dá)特征，同時(shí)獲得了大量與連作障礙相關(guān)的EST序列，為研究地黃連作障礙的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)這10個(gè)關(guān)鍵基因功能的分析，該研究初步構(gòu)勒了連作地黃“毒害”的作用機(jī)理，為深入研究地黃連作障礙成因、解讀連作障礙的分子機(jī)理，開(kāi)發(fā)消減連作危害的有效技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：地黃；連作障礙；抑制性消減雜交；c