花椰菜抗黑腐病消減cDNA文庫的構(gòu)建和分析

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1、第43卷第2期南開大學學報(自然科學版)Vo1．43N_O22010年4月ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNankaiensisApr．2010文章編號：0465—7942(2010)02—0015—08花椰菜抗黑腐病消減eDNA文庫的構(gòu)建和分析江漢民，郝擘，于雪梅，李愛，王春國，孫德嶺。，宋文芹(1．南開大學生命科學學院，天津300071；2．天津科潤蔬菜研究所，天津300384)摘要：為全面探索花椰菜抗黑腐病的機理，以花椰菜抗黑腐病近等基因系C71

2、2(抗病系)和C731(感病系)為試驗材料，構(gòu)建了一個C712受黑腐病菌誘導表達的正向消減eDNA文庫，文庫共包含1476個陽性克?。?jīng)斑點雜交篩選后選擇了280個陽性克隆進行測序，獲得266條通讀ESTs．將獲得的ESTs去除載體和接頭序列以及重復序列后，共得到202條單一序列．利用NCBI的BlastX軟件對所得序列進行蛋白序列同源性比對，結(jié)果顯示，182條序列在蛋白數(shù)據(jù)庫中可以找到同源序列，主要涉及物質(zhì)及能量代謝、信號傳導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、苯丙氨酸代謝途徑及防衛(wèi)反應等方面．2O個ESTs在Gen

3、Bank中沒有查到對應的同源序列，可能是新基因．eDNA文庫的構(gòu)建為進一步研究花椰菜抗黑腐病相關(guān)基因及抗病的分子機制奠定了基礎．關(guān)鍵詞：花椰菜(Brassicaoleraceawar．botrytis)；黑腐??；cDNA文庫；抑制性消減雜交中圖分類號：Q75文獻標識碼：A0引言花椰菜(Brassicaoleraceavar．botrytis)是十字花科蕓薹屬甘藍的一個變種，具有較高的營養(yǎng)價值和一定的抗癌功效，深受人們的喜愛，近年來在我國的種植面積越來越大，但隨著菜田復種指數(shù)的提高和生態(tài)條件的改變

4、，由野油菜黃單胞桿菌(Xanthomonascampetrispv．campetris，Xcc)引起的黑腐病的發(fā)病率越來越高，為害日趨嚴重，直接影響花椰菜花球的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為生產(chǎn)上迫切需要解決的問題．研究花椰菜抗黑腐病的機制，尋找抗病育種新方法是解決此問題的有效途徑．抑制性消減雜交技術(shù)(suppressionsub—tractivehybridization，SSH)是一種快速有效分離差異表達基因的方法，對高、低豐度的差異表達基因均能有效分離川．以抗黑腐病的花椰菜C712及其感病的近等基因系(

5、near—isogeniclines，NILs)C731為材料，利用SSH技術(shù)富集在Xcc侵染后抗黑腐病品系中差異表達的基因，構(gòu)建ssHcDNA文庫．通過基因功能分析，初步了解抗病花椰菜在與Xcc的互作中涉及的信號傳導途徑及抗病相關(guān)基因表達的種類、數(shù)量以及功能，為進一步認識花椰菜抗黑腐病的機制，挖掘和利用花椰菜重要抗病基因奠定基礎．1材料與方法1．1材料所采用的植物材料為一對花椰菜抗黑腐病的NILsC731和C712品系，其中C731為感病系作為回歸親本，C712是供體親本C5與C731雜交后得

6、到的抗性植株，并與C731回交6代得到的抗病系(BCeFz)．所用致病菌為野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampetrispv．campetris，Xcc)，以上材料由天津科潤蔬菜研究所提供．1．2方法1．2．1材料的處理：供試材料的種子在5O。C水中處理10min，然后播種于裝有滅菌土的營養(yǎng)缽內(nèi)，置于溫室中．待植株長到4片葉時，對植株進行處理．致病菌的接種及樣品的采集參照文獻[2]進行．收稿日期：2009—02—18基金項目：國家973計劃前期研究專項(2007CB116202)作者簡

7、介：江漢民(1981一)，男，山東青州人，博士研究生·16·南開大學學報(自然科學版)第43卷1．2．2葉片總RNA的提取與mRNA的分離、純化：采用Trizol法分別提取抗感病材料脅迫后的總RNA．mRNA的分離純化依照PolyATractmRNAIsolationSystemⅢ(Promega，USA)的方法進行．純化后的mRNA調(diào)整濃度為0．5g／L，作為構(gòu)建SSH文庫的起始材料．1．2．3抑制性消減雜交：mRNA的反轉(zhuǎn)錄和抑制性消減雜交具體操作參照Clontech的PCR—SelectT

8、McDNASubtractionKits(Clontech，USA)的方法進行，以抗性材料的cDNA為Tester，感病材料的cDNA為Driver．1．2．4消減cDNA文庫的構(gòu)建：將消減雜交第二輪PCR擴增產(chǎn)物進行純化，按照pGEM—Teasy(Promega，usA)載體試劑盒提供的方法將PCR產(chǎn)物與載體進行連接．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coli感受態(tài)細胞JM109，并涂于含Amp／X—gal／IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37C培養(yǎng)過夜．1．2．5陽性克隆的檢測：挑取轉(zhuǎn)化平板上的白色菌落，在含Am