傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因消減cdna文庫的構(gòu)建

《傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因消減cdna文庫的構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因消減cDNA文庫的構(gòu)建:張萍，山麗梅，肖小河，付強(qiáng)【關(guān)鍵詞】內(nèi)皮，血管/細(xì)胞學(xué)；抑制消減雜交；動(dòng)脈硬化【Abstract】AIM:ToconstructasubtractedcDNAlibraryofdifferentiallyexpressedgenesinfreshlyisolatedadultbovineaorticendothelialcells(FiBEC)andculturedneentsofnonexpressedorloentsplifiedlibraryl

2、ypickedandidentifiedusingrestrictionenzymedigestion.RESULTS:Theamplifiedlibrarycontainedmorethan760bacterialclones.The64clonespickedrandomlyshoedigestion.CONCLUSION:Thelibrarylaysafoundationforscreeningandcloningthearteriosclerosisrelatedgenesinearlystage

3、.【Key;vascular/cytology;suppressionsubtractivehybridization;arteriosclerosis【摘要】目的：構(gòu)建傳代培養(yǎng)前后牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫，篩選動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)新基因構(gòu)建文庫.方法：采用抑制消減雜交技術(shù)，以新鮮分離和傳代培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作為對(duì)比材料，分離傳代培養(yǎng)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)基因的cDNA片段，將其與T載體進(jìn)行T/A連接構(gòu)建文庫，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行文庫擴(kuò)增后，隨機(jī)挑取64個(gè)白色克隆進(jìn)行酶

4、切鑒定.結(jié)果：擴(kuò)增消減cDNA文庫獲得760個(gè)克隆，隨機(jī)挑取的64個(gè)陽性克隆經(jīng)酶切后均有200?600bp的插入片段.結(jié)論：構(gòu)建的傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因消減cDNA文庫，為進(jìn)一步篩選早期發(fā)生改變的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因奠定了工作基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】內(nèi)皮，血管/細(xì)胞學(xué)；抑制消減雜交；動(dòng)脈硬化0引言動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素?fù)p傷性疾病，許多基因在病變過程中均發(fā)生了改變，對(duì)發(fā)生變化的基因的深入認(rèn)識(shí)將為探尋動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理及病變特征提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ).國內(nèi)外報(bào)道的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因多是oxLDL損傷前后

5、培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因，所報(bào)道的許多基因的變化是與動(dòng)脈粥樣硬化病變中發(fā)生改變的因子相吻和的［1］.但尚不具備病變組織特異性和病理損傷特異性.在血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)后和動(dòng)脈粥樣硬化病變?cè)缙诙及l(fā)生G蛋白偶聯(lián)受體功能的明顯減弱或喪失［2-3］，從這一點(diǎn)上講血管內(nèi)皮細(xì)胞離體培養(yǎng)過程模擬了動(dòng)脈粥樣硬化病變?cè)缙谘軆?nèi)皮細(xì)胞發(fā)生的病理改變.本研宄采用SSHR技術(shù)，構(gòu)建新鮮分離的成牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和傳代培養(yǎng)的新生牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞差異表達(dá)基因的消減cDNA文庫，為進(jìn)一步篩選早期發(fā)生改變的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因奠定工作

6、基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料成牛主動(dòng)脈（購自北京市大紅門淸真食品廠）培養(yǎng)分離后獲得新鮮內(nèi)皮細(xì)胞；傳代（10代）培養(yǎng)的新生牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（美國CnBEC公司）；大腸桿菌菌株TG1本室保存；載體pGEMT，磁珠分離mRNA提取試劑盒（美國Promega公司）；總RNA提取Trizol試劑，DMEM培養(yǎng)基干粉，胎牛血清，SuperScriptTMRNaseH活性缺失反轉(zhuǎn)錄酶（美國GibcoBRL公司）；抑制削減雜交試劑盒（美國Clontech公司）；質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒（上海華舜公司）；IP

7、TG，Xgal,TaqDNA聚合酶（上海生工公司）；保真LATaq酶，DL2000核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（大連TaKaRa公司）.1.2方法1.2.1牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA及mRNA分離提取參照Trizol試劑說明進(jìn)行RNA提取；參照Z5300磁珠分離mRNA試劑盒操作說明進(jìn)行mRNA分離提取.1.2.2抑制消減雜交參照文獻(xiàn)［4］及SSH試劑盒說明以FiBECcDNA為檢測(cè)子（Tester），以CnBECcDNA為驅(qū)趕子（Driver）.①雙連cDNA的合成：取Tester和DrivermRNA各2Pg（4u

8、L）分別與1uLcDNA合成引物混合，在3.3X108nkat/LAMV反轉(zhuǎn)錄酶1uL作用下合成第一鏈cDNA.立即在第一鏈合成反應(yīng)液中加入20X第二鏈酶混合物、dNTP等，16°C反應(yīng)30min,合成雙鏈cDNA.抽提并沉淀cDNA,將沉淀物溶于50uL滅菌水中.②雙鏈cDNA的酶切：取Tester和Driver雙鏈cDNA各43.5uL，分別用RsaI1.5PL于37°C酶切1.5h.將未經(jīng)酶切的dscDNA2.5UL與經(jīng)