傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞差異表達基因消減cdna文庫的構(gòu)建

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1、傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞差異表達基因消減cDNA文庫的構(gòu)建:張萍，山麗梅，肖小河，付強【關鍵詞】內(nèi)皮，血管/細胞學；抑制消減雜交；動脈硬化【Abstract】AIM:ToconstructasubtractedcDNAlibraryofdifferentiallyexpressedgenesinfreshlyisolatedadultbovineaorticendothelialcells(FiBEC)andculturedneentsofnonexpressedorloentsplifiedlibraryl

2、ypickedandidentifiedusingrestrictionenzymedigestion.RESULTS:Theamplifiedlibrarycontainedmorethan760bacterialclones.The64clonespickedrandomlyshoedigestion.CONCLUSION:Thelibrarylaysafoundationforscreeningandcloningthearteriosclerosisrelatedgenesinearlystage

3、.【Key;vascular/cytology;suppressionsubtractivehybridization;arteriosclerosis【摘要】目的：構(gòu)建傳代培養(yǎng)前后牛主動脈內(nèi)皮細胞差異表達基因的消減cDNA文庫，篩選動脈粥樣硬化相關新基因構(gòu)建文庫.方法：采用抑制消減雜交技術，以新鮮分離和傳代培養(yǎng)的牛主動脈內(nèi)皮細胞作為對比材料，分離傳代培養(yǎng)主動脈內(nèi)皮細胞中不表達或低表達基因的cDNA片段，將其與T載體進行T/A連接構(gòu)建文庫，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行文庫擴增后，隨機挑取64個白色克隆進行酶

4、切鑒定.結(jié)果：擴增消減cDNA文庫獲得760個克隆，隨機挑取的64個陽性克隆經(jīng)酶切后均有200?600bp的插入片段.結(jié)論：構(gòu)建的傳代培養(yǎng)前后內(nèi)皮細胞差異表達基因消減cDNA文庫，為進一步篩選早期發(fā)生改變的動脈粥樣硬化相關基因奠定了工作基礎.【關鍵詞】內(nèi)皮，血管/細胞學；抑制消減雜交；動脈硬化0引言動脈粥樣硬化是一種多因素損傷性疾病，許多基因在病變過程中均發(fā)生了改變，對發(fā)生變化的基因的深入認識將為探尋動脈粥樣硬化的發(fā)病機理及病變特征提供堅實的理論基礎.國內(nèi)外報道的動脈粥樣硬化相關基因多是oxLDL損傷前后

5、培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞差異表達的基因，所報道的許多基因的變化是與動脈粥樣硬化病變中發(fā)生改變的因子相吻和的［1］.但尚不具備病變組織特異性和病理損傷特異性.在血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)后和動脈粥樣硬化病變早期都發(fā)生G蛋白偶聯(lián)受體功能的明顯減弱或喪失［2-3］，從這一點上講血管內(nèi)皮細胞離體培養(yǎng)過程模擬了動脈粥樣硬化病變早期血管內(nèi)皮細胞發(fā)生的病理改變.本研宄采用SSHR技術，構(gòu)建新鮮分離的成牛主動脈內(nèi)皮細胞和傳代培養(yǎng)的新生牛主動脈內(nèi)皮細胞差異表達基因的消減cDNA文庫，為進一步篩選早期發(fā)生改變的動脈粥樣硬化相關基因奠定工作

6、基礎.1材料和方法1.1材料成牛主動脈（購自北京市大紅門淸真食品廠）培養(yǎng)分離后獲得新鮮內(nèi)皮細胞；傳代（10代）培養(yǎng)的新生牛主動脈內(nèi)皮細胞（美國CnBEC公司）；大腸桿菌菌株TG1本室保存；載體pGEMT，磁珠分離mRNA提取試劑盒（美國Promega公司）；總RNA提取Trizol試劑，DMEM培養(yǎng)基干粉，胎牛血清，SuperScriptTMRNaseH活性缺失反轉(zhuǎn)錄酶（美國GibcoBRL公司）；抑制削減雜交試劑盒（美國Clontech公司）；質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒（上海華舜公司）；IP

7、TG，Xgal,TaqDNA聚合酶（上海生工公司）；保真LATaq酶，DL2000核酸分子質(zhì)量標準（大連TaKaRa公司）.1.2方法1.2.1牛主動脈內(nèi)皮細胞總RNA及mRNA分離提取參照Trizol試劑說明進行RNA提??；參照Z5300磁珠分離mRNA試劑盒操作說明進行mRNA分離提取.1.2.2抑制消減雜交參照文獻［4］及SSH試劑盒說明以FiBECcDNA為檢測子（Tester），以CnBECcDNA為驅(qū)趕子（Driver）.①雙連cDNA的合成：取Tester和DrivermRNA各2Pg（4u

8、L）分別與1uLcDNA合成引物混合，在3.3X108nkat/LAMV反轉(zhuǎn)錄酶1uL作用下合成第一鏈cDNA.立即在第一鏈合成反應液中加入20X第二鏈酶混合物、dNTP等，16°C反應30min,合成雙鏈cDNA.抽提并沉淀cDNA,將沉淀物溶于50uL滅菌水中.②雙鏈cDNA的酶切：取Tester和Driver雙鏈cDNA各43.5uL，分別用RsaI1.5PL于37°C酶切1.5h.將未經(jīng)酶切的dscDNA2.5UL與經(jīng)