mirna用熒光定量pcr檢測的完整流程

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1、一、miRNA簡介小RNA是19~28nt的調(diào)控RNA分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)和小干涉RNA(shortinterferingRNA，siRNA)兩類，其中的miRNAs成為繼siRNAs之后新的研究熱點之一，名列2002年和2003年美國《科學(xué)》雜志評出的年度十大科學(xué)成就。miRNAs是長片段RNA序列的一部分，同siRNAs一樣是比較短小的單鏈小分子RNA，一般來源于染色體的非編碼區(qū)域，由大約70nt大小的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體加工而來，它通過與其目標mRNA分子的3端非編碼區(qū)域(3-untranslatedregion，3UTR)互補導(dǎo)致該mR

2、NA分子的翻譯受到抑制。在miRNA公共數(shù)據(jù)庫miRBase(http://www.mirbase.org/)中已經(jīng)有1W多條來自不同物種的miRNA序列。MiRNA檢測方法要了解miRNA在基因調(diào)控中扮演的角色，很關(guān)鍵的一個方法就是迅速、準確地定量檢測miRNA基因的表達。因此，miRNA表達水平的檢測也成為了科學(xué)家們研究的熱點。但是由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。常用的檢測方法有：1.1Northernblotting1.2核糖核酸酶保護分析以及基于此方法的液相雜交。1.3RT-PCR也被用來檢測miRN

3、A前體的表達水平，其他基于PCR技術(shù)檢測miRNA的方法有：引物延伸法，就是在引物的5末端加一個特異標記，可以定量測定低豐度的RNA含量；原位雜交技術(shù)（CISH,FISH）可以方便的檢測miRNA的時空表達的差異。1.4芯片(microarrays)技術(shù)[46,47]是一種較快的研究miRNA表達的方法。二、反轉(zhuǎn)錄引物分類以及設(shè)計原理Real-timePCR方法克服了由于miRNA分子太短（~22nt）帶來的定量最大難題而引入靶向特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，該RT引物可以與成熟miRNA結(jié)合，形成反轉(zhuǎn)錄引物/成熟miRNA復(fù)合物，并在miRNA的5’末端延伸。這樣就得到一個較長的反轉(zhuǎn)錄

4、擴增因子，為進一步做實時定量PCR提供了符合要求的摸板。RT引物有兩種類型：1、Oligod(T)特異的RT引物（QIAGEN產(chǎn)品為主）由特異序列＋(T)20左右＋兼并堿基V或VN組成。（所有miRNA可以公用一個Oligod(T)的RT引物，但是RNA在反轉(zhuǎn)錄前需要進行末端Poly(A)加尾）2、莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物（ABI產(chǎn)品為主）由可以自身呈環(huán)莖狀的特異序列＋6到8個miRNA3’端反向互補堿基組成。(一條miRNA序列特異對應(yīng)一個莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物）。三、引物探針設(shè)計由于反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為（miRNA+RT引物）復(fù)合片段。上游引物可以在miRNA自身序列上找，如

5、果GC含量太低，可以在上游引物5’端加入GCGCC等的保護堿基；下游引物在RT引物的反向互補序列中找；也就是說：上游引物是每個miRNA所特有的，下游引物為通用引物就可以了。熒光定量PCR檢測方法有SYBRGreen染料法和TaqMan探針法。前者需要調(diào)整引物濃度以及引物擴增效率，把引物二聚體調(diào)整到越小越好；探針法則需要設(shè)計熒光探針，這其中由于MGB探針需要堿基數(shù)量少和特異性好的特點而被推薦（非廣告）。探針設(shè)計位置有3個：完全與miRNA序列相同、在miRNA與RT引物的交叉點、完全在RT引物上；這其中又有正向和反向互補兩種情況。至于探針要設(shè)計在那個位置，根據(jù)自己試驗情況而定，

6、本人以為效果都差不多。四、試驗操作流程1、RNA提取在以上兩種RT引物中，Ologod(T)特異引物所需要的RNA盡量是用特殊試劑盒提取的小RNA，而莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)RT引物需要RNA正常提取就好。另外由于所需樣本不同RNA提取方法也不完全相同，普通組織樣本和細胞可以研磨用Trizol＋氯仿抽提；血液和植物樣本需要前期處理后再用Trizol＋氯仿或用專門的Kit抽提。2、反轉(zhuǎn)錄確認用Oligod(T)特異RT引物時，RNA需要進行3'Poly(A)加尾處理。反轉(zhuǎn)錄的酶沒有特殊要求，操作請按照各自反轉(zhuǎn)錄酶的說明書進行就好。這里特別注意的是：反轉(zhuǎn)錄過程中用到的RT引物（常規(guī)的是隨機引物、

7、Oligod(T)和特異引物）是前面提到的Ologod(T)特異引物和莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)RT引物，它們分別屬于Oligod(T)和特異引物范疇，在反轉(zhuǎn)錄中不需要另外添加其他RT引物。在確定反轉(zhuǎn)錄溫度中請?zhí)貏e注意您使用的是哪一種RT引物，而設(shè)定相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄溫度。3、熒光定量PCR優(yōu)化PCR體系（引物濃度、Mg濃度、dNTP濃度、退火溫度等），正常操作。