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1、·加尾反轉(zhuǎn)錄法則是利用?poly(A)聚合酶為成熟的miRNA?加上?poly(A)尾巴，然后用錨定引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得加長?cDNA?的第一鏈。最后使用與通用?標簽序列互補的反向引物對?miRNA?表達進行熒光?定量?PCR?檢測。這種可以批量將所有成熟?miRNA?加上?poly(A)尾巴，然后進行反轉(zhuǎn)錄和檢測。莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法利用可以折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，通過與?miRNA?的?3’端堿基互補進行反轉(zhuǎn)錄，生成?cDNA?第一鏈，進行熒光定量?PCR?檢測，該方法是將反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所以特異性和靈敏性較高，?可以有效區(qū)分只相差幾個堿基的同家族?miRNA
2、?的不同成員，莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法對引物的要求較高，需要引物在反轉(zhuǎn)錄階段形成莖環(huán)式的正確構(gòu)型。??miRNA實時熒光定量PCR關(guān)鍵詞：?miRNA?實時熒光?定量?PCR2013-12-0200:00?來源：互聯(lián)網(wǎng)?點擊次數(shù)：1101實時熒光定量PCR從1996年美國AppliedBiosystems公司推出實時熒光定量PCR技術(shù)以來，該技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用到各類RNA的研究中，成為研究RNA必不可少的實驗手段之一。目前比較常用的方法有兩種：（1）TaqMan熒光探針法：該方法在特異性探針的兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，熒光基團發(fā)光被淬
3、滅基團吸收；在PCR擴增過程中，探針被降解，熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)出可被檢測到的熒光，以此來監(jiān)測整個PCR過程。（2）SYBR熒光染料法：該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)光的特性，檢測PCR的全部進程，從而判定初始RNA的量。常用的miRNA第一鏈合成方法成熟的miRNA大小只有22nt左右，在用實時熒光定量PCR檢測miRNA時，難點在于如何識別如此小的miRNA并合成第一鏈。目前常用的用于識別并合成miRNA第一鏈的方法主要有頸環(huán)法和加尾法兩種。（1）頸環(huán)法原理圖（2）加尾法原理圖????由于成熟miRNA較小，無法用常規(guī)
4、的方法直接進行反轉(zhuǎn)錄、PCR。所以上述兩種方法分別加PolyA尾及頸環(huán)結(jié)構(gòu)的方法，將miRNA配對的序列延長，然后進行正常的反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的PCR檢測。頸環(huán)法只針對成熟miRNA，特異性相對較高，但操作繁瑣，成本較高；加尾法可以檢測到成熟miRNA及pre-miRNA，特異性稍低，但操作及引物設(shè)計簡單。分段探針捕獲miRNA近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了越來越多的miRNA，其中有很多miRNA序列相近，有的僅僅只有一個堿基差異。這些不同的miRNA雖然序列相近，但是也有著不同的來源及功能。上述兩種方法雖然解決了miRNA的識別及后續(xù)PCR問題，但是無法分辨這些只有一個或者
5、兩個堿基差異的miRNA。美國Signosis推出了一種新的miRNA識別方法，可以分辨僅有單個堿基差異的miRNA。??美國Signosis推出的新方法，使用多對寡核苷酸對目的miRNA進行識別，單個堿基差異就可以破壞寡核苷酸與靶標序列的結(jié)合，從而分辨單個堿基差異的miRNA；同時該方法不用進行方轉(zhuǎn)錄，避免了反轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)錯配的可能；同時，這個新方法還引入了磁珠分離技術(shù)，在進行PCR前，通過結(jié)合有鏈霉親和素的磁珠對特異性標記有生物素的靶標序列進行純化，大大提高了特異性。武漢中幟生物攜手美國Signosis，為廣大科研用戶提供特異性更高、分辨率更強的miRNA實
6、時熒光定量PCR檢測試劑。來源：??????與雜交方法相比，實時熒光定量PCR方法可以高度靈敏地檢測出低豐度的靶miRNA。Signosis應(yīng)用T7-OLA（寡核苷酸連接）專利技術(shù)和SYBRgreen實時熒光定量PCR技術(shù)，開發(fā)了一種高靈敏度、高分辨力的實時熒光定量PCR試驗方法，可直接對細胞裂解產(chǎn)物中的miRNA表達進行定量分析，無需總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄。A.?????產(chǎn)品優(yōu)勢?無需?RNA?制備——細胞裂解產(chǎn)物可直接用于實驗（總RNA亦可）
7、；分辨率高?——能分辨僅有單個堿基差異的miRNA；實時——分析可以實時監(jiān)測；自有專利——應(yīng)用T7-OLA（寡核苷酸連接）專利技術(shù)。B.??????技術(shù)原理??????靶miRNA分子與兩條寡核苷酸（oligo）連接，形成RNA/DNA雜合體。含有生物素（biotin，B）的短序列互補結(jié)合到其中的一個oligo上。通過結(jié)合有鏈霉親和素（Streptavidin）的磁珠分離出雜合體。用DNA連接酶連接兩條oligo。單個核苷酸的差異就會阻止雜合體的形成或兩條oligo的連接。寡核苷酸對連接上后，連接分子可進行實時熒光定量PCR。C.?????原理示意圖???D.??
8、???結(jié)果
