mirna 熒光定量方法

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1、·加尾反轉(zhuǎn)錄法則是利用?poly(A)聚合酶為成熟的miRNA?加上?poly(A)尾巴，然后用錨定引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得加長?cDNA?的第一鏈。最后使用與通用?標(biāo)簽序列互補(bǔ)的反向引物對?miRNA?表達(dá)進(jìn)行熒光?定量?PCR?檢測。這種可以批量將所有成熟?miRNA?加上?poly(A)尾巴，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和檢測。莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法利用可以折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，通過與?miRNA?的?3’端堿基互補(bǔ)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成?cDNA?第一鏈，進(jìn)行熒光定量?PCR?檢測，該方法是將反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所以特異性和靈敏性較高，?可以有效區(qū)分只相差

2、幾個(gè)堿基的同家族?miRNA?的不同成員，莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法對引物的要求較高，需要引物在反轉(zhuǎn)錄階段形成莖環(huán)式的正確構(gòu)型。??miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR關(guān)鍵詞：?miRNA?實(shí)時(shí)熒光?定量?PCR2013-12-0200:00?來源：互聯(lián)網(wǎng)?點(diǎn)擊次數(shù)：1101實(shí)時(shí)熒光定量PCR從1996年美國AppliedBiosystems公司推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以來，該技術(shù)已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用到各類RNA的研究中，成為研究RNA必不可少的實(shí)驗(yàn)手段之一。目前比較常用的方法有兩種：（1）TaqMan熒光探針法：該方法在特異性探針的兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒

3、光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)光被淬滅基團(tuán)吸收；在PCR擴(kuò)增過程中，探針被降解，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出可被檢測到的熒光，以此來監(jiān)測整個(gè)PCR過程。（2）SYBR熒光染料法：該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)光的特性，檢測PCR的全部進(jìn)程，從而判定初始RNA的量。常用的miRNA第一鏈合成方法成熟的miRNA大小只有22nt左右，在用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miRNA時(shí)，難點(diǎn)在于如何識別如此小的miRNA并合成第一鏈。目前常用的用于識別并合成miRNA第一鏈的方法主要有頸環(huán)法和加尾法

4、兩種。（1）頸環(huán)法原理圖（2）加尾法原理圖????由于成熟miRNA較小，無法用常規(guī)的方法直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR。所以上述兩種方法分別加PolyA尾及頸環(huán)結(jié)構(gòu)的方法，將miRNA配對的序列延長，然后進(jìn)行正常的反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的PCR檢測。頸環(huán)法只針對成熟miRNA，特異性相對較高，但操作繁瑣，成本較高；加尾法可以檢測到成熟miRNA及pre-miRNA，特異性稍低，但操作及引物設(shè)計(jì)簡單。分段探針捕獲miRNA近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了越來越多的miRNA，其中有很多miRNA序列相近，有的僅僅只有一個(gè)堿基差異。這些不同的miRNA雖然序列相近，

5、但是也有著不同的來源及功能。上述兩種方法雖然解決了miRNA的識別及后續(xù)PCR問題，但是無法分辨這些只有一個(gè)或者兩個(gè)堿基差異的miRNA。美國Signosis推出了一種新的miRNA識別方法，可以分辨僅有單個(gè)堿基差異的miRNA。??美國Signosis推出的新方法，使用多對寡核苷酸對目的miRNA進(jìn)行識別，單個(gè)堿基差異就可以破壞寡核苷酸與靶標(biāo)序列的結(jié)合，從而分辨單個(gè)堿基差異的miRNA；同時(shí)該方法不用進(jìn)行方轉(zhuǎn)錄，避免了反轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)錯(cuò)配的可能；同時(shí)，這個(gè)新方法還引入了磁珠分離技術(shù)，在進(jìn)行PCR前，通過結(jié)合有鏈霉親和素的磁珠對特異性標(biāo)

6、記有生物素的靶標(biāo)序列進(jìn)行純化，大大提高了特異性。武漢中幟生物攜手美國Signosis，為廣大科研用戶提供特異性更高、分辨率更強(qiáng)的miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑。來源：??????與雜交方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以高度靈敏地檢測出低豐度的靶miRNA。Signosis應(yīng)用T7-OLA（寡核苷酸連接）專利技術(shù)和SYBRgreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，開發(fā)了一種高靈敏度、高分辨力的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)方法，可直接

7、對細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的miRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析，無需總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄。A.?????產(chǎn)品優(yōu)勢?無需?RNA?制備——細(xì)胞裂解產(chǎn)物可直接用于實(shí)驗(yàn)（總RNA亦可）；分辨率高?——能分辨僅有單個(gè)堿基差異的miRNA；實(shí)時(shí)——分析可以實(shí)時(shí)監(jiān)測；自有專利——應(yīng)用T7-OLA（寡核苷酸連接）專利技術(shù)。B.??????技術(shù)原理??????靶miRNA分子與兩條寡核苷酸（oligo）連接，形成RNA/DNA雜合體。含有生物素（biotin，B）的短序列互補(bǔ)結(jié)合到其中的一個(gè)oligo上。通過結(jié)合有鏈霉親和素（Streptavidin）的磁珠分離

8、出雜合體。用DNA連接酶連接兩條oligo。單個(gè)核苷酸的差異就會阻止雜合體的形成或兩條oligo的連接。寡核苷酸對連接上后，連接分子可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。C.?????原理示意圖???D.?????結(jié)果