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1、熒光分光光度法測定維生素B2的含量實驗報告——應(yīng)用化學（環(huán)境檢測與分析）一、實驗目的1、掌握標準曲線法定量分析維生素B2的基本原理。2、了解熒光分光光度計的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，掌握其基本操作。二、實驗原理1什么是熒光？熒光是光致發(fā)光。當物質(zhì)的分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射的光。23熒光與環(huán)境因素的關(guān)系取代基的性質(zhì)、溶劑的極性、體系的pH和溫度。維生素B2(VitaminB2)，別名：核黃素(Riboflavin，RF)，是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶,分子式：C17H20N4O6，相對分子量為：376.37。因其色黃且含有核糖醇，故稱為核黃素。結(jié)構(gòu)式為：
2、5由于分子中有三個芳香環(huán)，具有平面剛性結(jié)構(gòu)，因此它能夠發(fā)射熒光。維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430—440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm附近。維生素B2在pH＝6—7的溶液中熒光強度最大，而且其熒光強度與維生素B2溶液濃度呈線性關(guān)系，因此可以用熒光光譜法測維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)——光黃素，光黃素也是一個能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素B2的熒光強得多，故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。在稀溶液中，熒光強度F
3、與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系：F＝2.303ФI0εbc當實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系：F=Kc這是熒光光語法定量分析的依據(jù)。三、儀器與試劑1、主要儀器：熒光分光光度計（日立F—7000）；比色皿：1cm；容量瓶：50mL；移液管：5mL。2、試劑：核黃素；維生素B2藥片四、實驗步驟1. 溶液的配制標準溶液的配制：精確稱取2mg核黃素(VB2)，用超純水于50ml棕色容量瓶中定容待測液的配制：將維生素B2藥片研磨成粉末狀，精確稱取2mg，用超純水于50ml棕色容量瓶中定容；2. 掃描激發(fā)光譜和熒光光譜3. 標準曲線的繪制在室溫條件下，分別吸取1.0、2.0、3.0、
4、4.0、5.0標準溶液于50ml棕色容量瓶中定容。用超純水作空白試樣，測定溶液熒光強度值。用所測結(jié)果繪制熒光強度(F)對濃度(c)的曲線。4. 待測液VB2含量的測定及數(shù)據(jù)處理5五、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理λex＝442nm5λem＝524nmVB2標準曲線及藥片中VB2含量的測定（大濃度）VB2標準曲線及藥片中VB2含量的測定（稀釋到中間濃度）5六、總結(jié)、討論1、實驗注意事項：（1）配制標準溶液時，為了減少儀器偏差，取不同體積的同種溶液應(yīng)用同一移液管。（2）因熒光是從石英池下部通過，所以拿取石英池時，應(yīng)用手指捏住池體的上部，不能接觸下部。清洗樣品池后，應(yīng)先用吸水紙吸干四個面的液滴，再用擦
5、鏡紙往同一方向進行輕輕擦拭。（3）在使用熒光分光光度計時，須按照既定程序進行。在測定系列標準溶液的濃度和熒光強度時，必須按順序放入測定。（4）在測試樣品時，應(yīng)注意樣品的濃度不能太高，否則由于存在熒光猝滅效應(yīng)，樣品濃度與熒光強度不呈線性關(guān)系，造成定量工作出現(xiàn)誤差。2、此次實驗，影響標準曲線的線性的主要因素是配制溶液時，操作是否規(guī)范、標準。七、思考題1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測十分微弱光信號的能力，并且熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度也可以增大熒光強度，使測定的靈敏度提高；而吸收光度法測定的是吸光度，不管是增大入射光強度，還是提高
6、檢測器的靈敏度，都會使透射光信號與入射光信號以同樣的比例增大，吸光度值不會改變，因此靈敏度不能提高。2、維生素B2在pH=6~7時熒光最強，本實驗為何在酸性溶液中測定？答：因為維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射，會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，后者的熒光比維生素B2的熒光強的多。因此，測量時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)進行。5
